Effect of Lys99Gln and Asp97Gly mutation in lachancea thermotolerance asparaginase active site on substrate affinity

Abstract

L-asparaginazlar (L-ASNaz), L-asparajinin L-aspartik asit ve amonyağa dönüşümünü katalize eden baskın L-asparaginaz aktivitesine sahip amidohidrolaz enzimleridir. Ayrıca bazılarının ikincil L-glutaminaz aktivitesi vardır. Bu özellikleri nedeniyle L-asparaginaz, akut lenfoblastik löseminin (ALL) tedavisinde kullanılır. Elspar® ve Erwinaz® L-asparaginazlar ilaç endüstrisinde terapötik ürünler üretmek için yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak aşırı duyarlılık reaksiyonları ticari L-asparaginazların ana sınırlamalarıdır. Bu durum bilim adamlarını yeni kaynaklardan gelecek vaat eden L-asparaginazları aramaya zorladı. Bu nedenle, maya L-ASNazlarının alternatif kaynaklarının araştırılması, toksisitenin azaltılması ve etkinliğin arttırılması konusunda ümit vericidir; yine de bu kaynakların araştırılması sınırlı kalmaktadır. Bu çalışma, sahaya yönelik mutajenezin Lachancea thermotolerance (Lt) LtASNase enzim yapıları üzerindeki etkilerini incelemektedir. Enzimin Lys99Gln ve Asp97Gly bölgelerine odaklanan çalışmada KM ve kcat değerleri elde edilerek yabani tip enzimle karşılaştırıldı. Modelleme çalışması için SwissModel kullanılmıştır. Mutant ve yabani tipin kinetik özellikleri incelendiğinde Lys99Gln LtASNase'nin yabani tipe göre daha yüksek KM ve daha düşük kcat'a sahip olduğu görüldü. Asp97Gly mutasyonu kinetik parametreleri tahmin etmek için çok düşük aktiviteye sahiptir. Bu çalışma LtASNase enziminin yapısını ve etkileşimlerini aydınlatmak için önemli bir adım oluşturmaktadır. Yukarıda bahsedilen mutant enzim kinetiği çalışmalarına ek olarak depolama aktivitesi çalışmaları da yapılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda depolama süresi arttıkça enzimin bağıl aktivitesinin azaldığı, en uygun saklama sıcaklığının -80°C olduğu sonucuna varılmıştır.L-asparaginases (L-ASNase) are amidohydrolase enzymes which have a predominant L-asparaginase activity that catalyzes the conversion of L-asparagine to L-aspartic acid and ammonia. Also, some of them have secondary L-glutaminase activity. For this properties L-asparaginase is used to treat acute lymphoblastic leukemia (ALL). Elspar® and Erwinaz® L-asparaginases are widely used in the pharmaceutical industry to produce therapeutic products. But the hypersensitivity reactions are the main limitations of commercial L-asparaginases. This situation has forced scientists to search for promising L-asparaginases from new sources. Hence, the exploration of alternate sources of yeast L-ASNases holds promise in mitigating toxicity and improving efficacy; nevertheless, the investigation of these sources remains limited. This study examines the effects of site-directed mutagenesis on LtASNase enzyme structures from Lachancea thermotolerance (Lt). In the study focusing on the Lys99Gln and Asp97Gly regions of the enzyme, KM and kcat values were obtained and compared with the wild-type enzyme. SwissModel was used for the modelling study. When mutant and wild-type kinetic characteristics were examined, Lys99Gln LtASNase has a higher KM and lower kcat than wild-type. The Asp97Gly mutation has too low activity to estimate kinetic parameters. This study constitutes an important step for elucidating the LtASNase enzyme structure and interactions. In addition to the mutant enzyme kinetic studies mentioned above, storage activity studies were also carried out. As a result of the experiments, it was concluded that as the storage time increased, the relative activity of the enzyme decreased, and the most suitable storage temperature was -80°C.