Alanine scanning mutagenesis to active site residues Ile94, Asn120 of NAD+ - dependent Chaetomium thermophilum formate dehydrogenase on CO2 reduction

Abstract

NAD+ bağımlı format dehidrojenazlar (FDH'ler) (EC 1.2.1.2), oksidoredüktaz enzim sınıfının bir üyesidir. FDH'ler sadece formatın CO2'ye dönüşümünü ve NAD+'yı NADH'ye indirgeyen kofaktör geri dönüşümünü katalize etmekle kalmaz, aynı zamanda Chaetomium thermophilum format dehidrojenazlar (CtFDH'ler) CO2'nin ters yönde indirgenmesini sağlar. Bu çalışmada bu amino asitlerin fonksiyonu hakkında bilgi sahibi olmak için Alanin Taramalı Mutagenez tekniği kullanılmıştır. Amino asitlerin Alanin ile yer değişimini temel alan bu yaklaşımda, Alanin amino asitinin inert özelliğinden faydalanılarak yan zincir fonksiyonları hakkında detaylı bilgilere ulaşılmasını mümkün kılmıştır. Yabanıl tip CtFDH enziminin aktif bölgesinde yer alan Ile94 ve Asn120 amino asitleri, uygun primerler tasarlanarak alanin amino asidi ile değiştirildi. Ile94Ala ve Asn120Ala mutasyonları dahil edildi. İki varyant (Ile94Ala, Asn120Ala), E. Coli BL21 (DE3) hücrelerinde ifade edildi. Mutant enzimin saflaştırılması, bir Ni-NTA HisTrap kolonu kullanılarak gerçekleştirildi. Aktivite ölçümleri, subsrat olarak sodyum format ve sodyum bikarbonatın varlığında gerçekleştirildi. Daha sonra, Michaelis-Menten kinetik değerleri, regresyonsuz analiz ile belirlendi. Ile94'ün ana zincirinden ve Asn120'nin yan zincirinden iki hidrojen bağı, formatın ikinci karbonil grubuna aittir. Asn120Ala varyantının formata karşı aktivite ölçümlerinde aktivitesini kaybettiği görülmüştür. Bikarbonata karşı alınan ölçümler, substrat afinitesinde bir azalma, ancak kataliz hızında bir artış gösterdi. Ile94Ala mutasyonu için, formata doğru aktivitede azalma görülmüştür. Ters reaksiyonda, substrat afinitesi azalırken, kataliz hızı artmıştır. Elde edilen sonuçlar, FDH aktif bölgesindeki yapı-fonksiyon ilişkilerini açığa çıkarmaya yardımcı olmuştur. Ayrıca kinetik sonuçlar, mutant FDH enziminin CO2 indirgemede potansiyeli olabileceğini ortaya koymuştur.The NAD+ dependent formate dehydrogenases (FDHs) (EC 1.2.1.2) are a member of oxidoreductase enzyme class. FDHs not only provide catalysing the conversion of formate into CO2 and cofactor recycling that reduces NAD+ to NADH, but also Chaetomium thermophilum formate dehydrogenases (CtFDHs) provide reduction of CO2 in the reverse direction. In this study, Alanine Scanning Mutagenesis technique was used to gain information about the function of these amino acids. This approach, which is based on the replacement of amino acids with alanine, made it possible to obtain detailed information about the side chain functions by using the inert property of alanine. Ile94 and Asn120 amino acids, which be located in the active site of the wild-type CtFDH enzyme, were replaced by the alanine amino acid by designing appropriate primers. Ile94Ala and Asn120Ala mutations were introduced. The two variants (Ile94Ala, Asn120Ala) were expressed in E.coli BL21 (DE3) cells. Purification of the mutant enzyme was carried out using a Ni-NTA HisTrap column. The activity measurements were performed in present of sodium formate and sodium bicarbonate as subsrate. Then, Michaelis-Menten kinetic values were determined by nonregressionanalysis. Two hydrogen bonds from the main chain of Ile94 and the side chain of Asn120 are to the second carbonyl group of formate. It was observed that the Asn120Ala variant loses its activity in the activity measurements against the formate. The measurements taken against bicarbonate showed a decrease in substrate affinity, but an increase in catalysis rate. For the Ile94Ala mutation, there was a decrease in activity towards the formate. In the reverse reaction, while the substrate affinity decreased, the catalysis rateincreased. The results obtained helped to reveal structure-function relationships in the FDH active site. Moreover, its kinetic results revealed that the mutant FDH enzyme may have a potential on CO2 reduction.