Streptomyces coelicolor A3(2)'de Lon proteazın ikincil metabolit üretimine etkisi

Abstract

Streptomyces'lerde ikincil metabolit üretimi ortamdaki besin kaynakları azalıp stres oluşmaya başladığında tetiklenir. Besin açlığı durumunda bakterilerde protein sentezi dururken protein yıkım işlemleri artar. Bakterilerde protein yıkımında, ATP bağımlı Lon proteazların önemi büyüktür. Lon proteazın ikincil metabolizmaya herhangi bir etkisinin olup olmadığı bilinmediğinden, bu tez çalışması kapsamında, Streptomyces coelicolor'da Lon proteazı üretemeyen ve normalden fazla üreten 2 ayrı mutant suş oluşturulması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda lon geninin kromozomdan silinmesi için "PCR temelli" bir metod kullanılmış ancak farklı denemelerin hepsinde çok yavaş ve zor büyüyen olası mutant hücreler elde edilmiş ve bu hücreleri alt kültürlemek mümkün olmamıştır. Bunun üzerine lon geninin S. coelicolor'ın yaşayabilmesi için oldukça önemli olduğu sonucuna varılmıştır. Çalışmanın devamında, S. coelicolor genomuna bir ekstra kopya lon geni entegre edilerek Lon proteazı normalden fazla üreten Sco-pRAlon rekombinant suşu elde edilmiştir. Rekombinant suşta öncelikle lon'un fazla ifade edildiği transkripsiyonel düzeyde gösterilmiş, daha sonra ikincil metabolizma üzerindeki etkisi belirlenmiştir. Yapılan antibiyotik ölçümleri sonucunda ekstra bir kopya lon geninin antibiyotik üretimini dramatik bir biçimde arttırdığı gösterilmiştir. Rekombinant suşta ?-amilaz aktivitesi de ölçülmüş, ekstra bir kopya lon geninin birincil metabolizmayı çok fazla etkilemediği belirlenmiştir. Farklı Streptomyces türlerinde lon'un aynı etkiyi gösterip göstermediğini araştırmak için sefamisin C üreticisi Streptomyces clavuligerus'a da ekstra bir kopya lon geni entegre edilmiş, ancak antibiyotik üretiminde sadece 1.5 katlık bir artış gözlenmiştir. Bu çalışmaların sonuçları, Lon proteazın Streptomyces ikincil metabolit üretimine etkisini gösteren ilk çalışma olması bakımından temel bilime katkı sağlamaktadır. Aynı zamanda, yüksek antibiyotik üreticisi Sco-pRAlon suşunun endüstriyel uygulamalarda kullanılabilecek olması bakımından biyoteknolojik açıdan da değerlidir.The production of secondary metabolites in Streptomyces, is triggered when the nutrients in the environment are reduced and stress begins to form. In case of nutrient starvation, protein synthesis in bacteria stops and protein degradation processes increase. ATP dependent Lon proteases're important proteases in protein degradation in bacteria. Since it isn't known whether Lon protease has any effect on secondary metabolism, the aim of this thesis is to produce two different mutant strains that don't produce Lon protease and produce excess than normal in Streptomyces coelicolor. For this purpose, a "PCR-based method" was used for deletion of the lon gene from the chromosome, however, in different experiments, possible mutant cells were grown slowly and it wasn't possible to subculture these cells. It was concluded that the lon gene is important for the survival of S. coelicolor A3(2). One extra copy lon gene was integrated into the S. coelicolor A3(2) genome to obtain the Sco-pRAlon recombinant strain that overexpress lon gene. As a result of antibiotic measurements, it was shown that extra one copy of lon gene dramatically increased antibiotic production. ?-amylase activity was also measured in the recombinant strain and it was determined that an extra copy lon gene didn't affect primary metabolism so much. To investigate whether lon has the same effect in different Streptomyces species, one copy of lon gene was also integrated into cefamycin C producer Streptomyces clavuligerus, but only 1.5-fold increase in antibiotic production was observed. The results of these studies contribute to the basic science since it's the first study showing the effect of Lon protease on secondary metabolite production in Streptomyces. At the same time the results are also biotechnologically valuable in that the high antibiotic producer Sco-pRAlon strain can be used in industrial applications.