Exploring novel CRY1 interactions

Abstract

Sirkadiyen saat neredeyse bütün canlı organizmaların metabolik ve genomik dengelerini düzenleyen, hücre içinde otomatik olarak oluşturulan 24 saatlik salınımlardan oluşan bir sistemdir. Moleküler düzeyde dört ana protein tarafından transkripsiyonel- translasyonel geribildirim döngüsü mekanizması ile kontrol edilir. Bu proteinlerden iki tanesi (BMAL1 ve CLOCK) aktivatör olarak görev alırken bu aktivatörlerin ürünü olan CRYPTOCHROME ve PERIOD proteinleri bu salınımın negatif düzenleyicileridir. Sirkadiyen saatteki bozulmalar genomik işlev bozuklukları ve metabolik hastalıklar ile önemli derecede ilişkilidir. Sirkadiyen saat proteini Cryptochrome 1 ve DNA hasar yanıtı arasındaki moleküler etkileşimi tanımlamak için bu proteinin interaktörlerinin ko-immünopresipitasyon metodu ile doğrulanması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda aday olarak seçilen interaktörler HA etiketi ile birleştirilip kalıcı olarak 3xFLAG-CRY1 eksprese eden HEK293T hücre hattına transfekte edilmiştir. İnteraktörlerin stabil hücre hattı tarafından protein düzeyinde ekspresyonu gerçekleştikten sonra protein lizatı anti-FLAG antikoru ile kaplanmış manyetik boncuklara yüklenmiştir. Aday interaktör proteinlerin varlığı anti-HA antikoru kullanılarak gerçekleştirilen western blot analizi ile onaylanmıştır. Sonuç olarak, CRY1 proteininin DNA hasar ve tamir yoklaklarıyla ilişkili olan bilinmeyen interaktörleri belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar CRY1'in hücreleri DNA hasarından koruyan ve ilaç terapilerinde hedeflenebilecek önemli bir gen olduğunu göstermiştir.Circadian clock is an internal autonomous 24-hour oscillating system that mainly sustains the metabolic and genomic homeostasis of almost all living organisms. At the molecular level, four main proteins manage the circadian rhythms via a transcriptional-translational feedback loop mechanism. Two of these proteins (BMAL1 and CLOCK) are the activators, contrarily CRYPTOCHROME and PERIOD, the product of these activators, are the negative regulators of the oscillation. Disruption of the circadian clock is considerably associated with genomic malfunctions and metabolic disorders. To identify the molecular interaction between circadian clock protein Cryptochrome 1 (CRY1) and DNA damage responses, the interactors of this protein were aimed to be validated by the co-immunoprecipitation method. An HA-tag was fused to the interactor candidates and the generated proteins were transfected into the 3xFLAG-CRY1 expressing stable HEK293T cell line for this purpose. After production of the interactors at the protein level by the stable cells, the protein lysate was loaded into the anti-FLAG antibody-coated magnetic beads. The presence of the interactor was confirmed by western blot analysis performed with an anti-HA antibody to detect the candidate proteins. To conclude, the novel interactors of the CRY1 protein related to DNA damage and repair pathways were identified. The results were demonstrated that CRY1 gene is an important protector of cells from DNA damages offering this gene can be targeted for drug therapies.