The investigation of the effect of halofuginone on apoptosis and cell cycle

Abstract

Bir çeşit akciğer kanseri olan malignant mezotelyoma uzun süreli asbeste maruz kalma sonucunda gelişir ve henüz tedavisi mümkün olmayan bir kanser türüdür. Bu durum hedefe yönelik yeni ajanların araştırılmasını zorunlu kılmaktadır. Son yıllarda bitkisel kaynaklı ajanların kanser hücrelerine yönelik etkilerinin anlaşılması bu konuyla ilgili çalışmaları hızlandırmıştır. Halofuginon bitkisel kaynaklı bir febrifugine analoğudur. Halofuginon'un, osteosarcoma hücrelerinde SMAD yolağını; kolon kanseri hücrelerinde AKT/mTORC1 yolağını baskıladığı; karaciğer kanseri hücrelerinde proliferasyonu ve invazyonu önlediği; myeloma hücrelerinde ise hücre döngüsünü tutukladığı bildirilmiştir. Bu tez kapsamında, bitkisel kaynaklı ve bazı hücrelerde anti-karsinojen olabilirliği işaret edilen Halofuginon molekülünün malignant mezotelyoma ve akciğer kanseri hücre hatlarında apoptoz ve hücre döngüsü üzerideki olası etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. İlk olarak, AO/EtBr boyama ile halofuginonun hücre canlılığı ve ölümü üzerindeki etkisi hem normal (MeT-5a) hem kanser hücrelerinde (SPC212 ve A549) görüntülenmiştir. Hücre ölüm tipini tayin edebilmek için apoptoz yolağındaki protein seviyelerindeki değişimler SDS/PAGE Western-Blot protein analizleriyle belirlendmiştir. Apoptoz varlığını desteklemek için Caspase-3 assay yapılmıştır. Son olarak, hücre döngüsü analizleri akış sitometrisi yöntemiyle tayin edilmiştir. AO/EtBr boyama sonuçları doğrultusunda HF malignant mezotelyoma ve akciğer kanseri hücre hatlarında hücre canlılığını konsantrasyon bağımlı olarak düşürdüğünü, hücre ölümünü attırdığını gösterirken, normal mezotel hücrelerde bu etkinin yüksek dozlarda olduğunu tespit ettik. Konsantrasyon bağımlı hücre ölümünün ise apoptoz ile olduğunu hem SDS-PAGE hem de caspase-3 assay yöntemleriyle destekledik. Hücre döngüsü analizleriyle HF'nin 250 nM dozundan itibaren SPC212 hücrelerini G0/G1 fazında tutukladığını gösterdik. Özetle bu araştırma sayesinde HF'nin malignant mezotelyoma ve akciğer kanseri hücre hücreleri üzerinde anti-karsinojen potansiyelinin olduğu belirlenmiştir.Pleural Malignant Mesothelioma develops as a result of prolonged asbestos exposure, and it is difficult to treat. Lately, it has been a great interest to use plant-derived drugs because of their specific effects on cancer cells. Halofuginone is a plant-derived compound, which has also anti-cancer effect. In this thesis, it is aimed to investigate the possible apoptotic and cell cycle arresting effect of Halofuginon molecule in malignant mesothelioma and lung cancer cell lines. Firstly, we visualized the effect of Halofuginone on cell viability and death with AO / EtBr staining in both normal (MeT-5A) and cancer cells (SPC212 and A549). Subsequently, changes in protein levels in the apoptosis pathway to determine the cell death type were assessed by SDS / PAGE Western-Blot protein analysis. The Caspase-3 assay was performed to support the presence of apoptosis. Finally, cell cycle analyses were evaluated by flow cytometry. According to the results of AO / EtBr staining, cell viability was decreased and the cell death rate was increased by HF in a concentration-dependent manner in both cancer lines. However, this effect was observed at high concentration of HF in normal mesothelial cells. The presence of apoptosis was measured both SDS-PAGE and Caspase-3 activity assay. The cell cycle analysis results showed that SPC212 cells were arrested at G0/G1 phase concentration greater than 250 nM of HF no alteration was detected in MeT-5A cell cycle after HF treatments. Our results suggest that HF has anti-carcinogenic potential on malignant mesothelioma and lung cancer cell in vitro. Key words: Halofuginone, mesothelioma, cell death, apoptosis, cell cycle.