Termofilik Geobacıllus Kaustophılus L-asparajinaz enziminin klonlanması, karakterizasyonu ve antitümör etkisinin belirlenmesi

Abstract

L-asparajinaz, hücrenin yaşamı ve protein sentezi için gerekli olan L-asparajin amino asidinin hidrolizini katalizleyen bir enzimdir. Normal hücreler, non-esansiyel amino asit olan asparajini üretebilirken; tümör hücrelerinin yaşamı dolaşımdaki kandan sağlanan L-asparajine bağlıdır. L-asparajinaz, kandaki L-asparajini azaltarak tümor hücrelerinin ölümüne sebep olmaktadır. Birçok mikroorganizma L-asparajinazı üretmesine rağmen temel olarak klinik ve törapatik uygulamalarda Escherichia coli ve Erwinia chrysanthemi'den elde edilen enzimler kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu bakterilerden elde edilen L-asparajinazların allerjik tepki ve kısa yaşam ömrü gibi istenmeyen yan etkileri bulunmaktadır. Güncel kullanılan enzimlerden farklı olarak daha etkin anti tümör aktivitesine sahip ve uzun yaşam ömürlü L-asparajinazlara gereksinim duyulmaktadır. Bilgilerimize göre, termostabil asparajinazlar ile yapılan ancak güncel enzimlerin sorunlarını henüz çözmeyen birkaç çalışma bulunmaktadır. Bu çalışmada, termofilik Geobacillus kaustophilus L- asparajinaz geni ilk defa L- asparajinaz geni pET-22b(+) vektöründe klonlanmış ve E. coli RosettaTM 2 (DE3) hücrelerinde ifade edilmiştir. C-terminalinde His6 etiketi içeren rekombinant protein saflaştırılmış ve enzim karakterize edilmiştir. Saflaştırılan GkASNaz'ın moleküler ağırlığı SDS-PAGE, Western Blot ve MALDI-TOF MS analiz ile ~36 kDa olarak belirtilmiştir. L-asparajii etkin şekilde hidrolize eden GkASNaz'ın optimum sıcaklığı 55°C ve pH'sı 8,5 olarak belirlenmiştir. Enzim aktivitesi Cu2+ Fe2+, EDTA ve EGTA varlığında inhibe olurken ve Mn2+, Mg2+ gibi iyonların ve 2-merkaptoetanol, DTT gibi tiol koruyucu ajanlar varlığında artış göstermiştir. GkASNaz antiproliferasyon özelliği xCELLigence sistemi ile yapılan çalışmalarla belirlenmiştir. Enzimin metastatik mezenşim HCC SNU387 hücrelerinde büyümeyi azalttığı gözlemlenmiştir.L-asparaginase is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of L-asparagine which is an amino acid required by cell for synthesis of protein and survival of the cell. L-asparaginase has long been used as a therapeutic agent in ALL and other related blood cancer. Unlike normal cells, L-asparagine cannot be produced by tumor cells. Therefore, the survival of tumor cells is dependent on the exogenous supply of L-asparagine from the blood. L-asparaginase depletes the available L-asparagine in the blood, causing inhibition of tumor cell survival. Although, several microorganisms are found to produce L-asparaginase, mainly E. coli and E. chrysanthemi orginated L-asparaginases are in use in clinical and therapeutic applications. However, these L-asparaginases have undesirable side effects such as allergic responses and short half-life. To our knowledge, there are also few studies dealing with thermostable asparaginases which do not solve the problems of current enzymes. In this study, thermopfilic Geobacillus kaustophilus L- asparaginase was cloned in pET-22b (+) vector and expressed in E. coli RosettaTM 2(DE3) cells. The recombinant protein contained His6 tag at C-terminus was purified and enzyme characterization was performed. The molecular mass of GkASNase was determined as ~ 36 kDa from SDS-PAGE, Western Blotting and MALDI-TOF MS analysis. The optimum temperature of GkASNaz, which hydrolyzes L-asparagine effectively, is 55 °C and its pH is 8.5. Enzyme activity was inhibited in the presence of Cu2+, Fe2+, EDTA, and EGTA and enhanced in the presence of ions such as Mn2+, Mg2+ and thiol protective agents as 2-mercaptoethanol, DTT. The GkASNaz antiproliferation property was determined by studies with the xCELLIgence system. It has been observed that the enzyme efficiently reduces metastatic synergy in HCC SNU387 cells.