Rekombinant Geobacillus kaustophilus HslV ve HslU proteinlerinin E. coli' den saflaştırılması ve nitelendirilmesi

Abstract

Hem ökaryotik hem de prokaryotik hücrelerde, birçok hücre içi proteinin yıkımı ATP-bağımlı proteazlar ile başlatılmaktadır. Son yıllarda tanımlanan ve izole edilen HslVU, ATP-bağımlı bir proteaz olup ökaryotik ve arkea proteazomun prokaryotik homoloğudur. HslVU, proteaz aktivitesine sahip HslV ile ATPaz aktivitesine sahip HslU altünitelerinden oluşmaktadır. Genom ve kristal yapı çalışmaları sonunda HslVU proteazlar hakkında son yıllarda oldukça geniş bilgi sağlanmıştır. Ancak, HslVU proteazların katalitik aktiviteleri ve fonksiyonları hakkındaki bilgi yeterli değildir. Bu çalışmada PGEX 6P-1 ekpresyon vektörüne daha önceden klonlanmış olan G. kaustophilus'a ait hslV ve hslU genleri Glutatyon S-Transferaz ile füzyon protein olarak eksprese edilmiş, saflaştırılmış ve biyokimyasal nitelendirilmesi gerçekleştirilmiştir. Ayrı ayrı E. coli'de eksprese edilip tek basamakta afinite kolan kromatografisi ile saflaştırılan HslV peptidaz ve HslU ATPaz proteinlerinin moleküler ağırlıkları, SDS-PAGE'de sırasıyla 19 kDa ve 50 kDa olarak belirlenmiştir. HslVU proteaz, proteazomun kimotripsin-benzeri aktivite deneylerinde kullanılan florogenik bir substrat olan CBZ-Gly-Gly-Leu-AMC'yi etkili bir şekilde hidrolize etmiştir. ATP varlığında, HslV peptidaz tek başına çok düşük aktivite göstermesine karşı HslU ile birlikte bulunduğunda aktivitesinde15 kat artış gözlenmiştir. HslVU'nun peptidaz aktivitesinin optimum sıcaklığı 55 °C `ve optimum pH aralığı 9.0- 11.0 olarak belirlenmiştir. HslVU proteaz aktivitesi için kofaktör olarak Mg2+'a ihtiyaç duymaktadır. G. kaustophilus HslVU peptidaz aktivitesi, laktasistin ile güçlü bir şekilde inhibe edilmiştir. HslVU proteaz kazeini ATP varlığında düşük oranda hidrolize ederken doğal bir protein substratı olan MBP-SulA'yı hidrolize edememiştir. HslU tek başına zayıf ATP hidroliz aktivitesi göstermiştir ancak HslV varlığında, HslVU ATPaz aktivitesinde 4.8 kat artış görülmüştür. Ayrıca, ATP ve HslV miktarındaki artış HslVU ATP hidrolizini artırmıştır.Both in eukaryotes and prokaryotes, degradation of many intracellular proteins is initiated by ATP-dependent proteases. Recently-identified and isolated heat-HslVU is an ATP-dependent proteolytic system and a prokaryotic homolog of the archaeal proteasome. HslVU consists of the proteolytic subunit HslV and ATPase subunit HslU. Important information on HslVU proteases has been obtained from the recent genomic and structural studies. However, little is known about the catalytic activities and functions of HslVU proteases. In this study, G. kaustophilus? hslV and hslU genes which are previously cloned into PGEX 6P-1 expression vector, were expressed with Glutahione S-Transferase, purified and biochemicaly characterized. The molecular weigths of HslV peptidase and HslU ATPase proteins, which were seperately expressed in E. coli and purified using one step affinity chromatography, were determined by SDS-PAGE as 19 kDa and 50 kDa, respectively. HslVU protease efficiently hydrolyzed CBZ-Gly-Gly-Leu-AMC, a florogenic substrate often used in chymotryptic-like proteasome activity assays. In the presence of ATP, HslV showed a very low peptidase activity, however when used together with HslU, the peptidase activity increased approximately 15 fold. Optimum temperature for HslVU protease activity was observed at 55 oC and optimal pH determined at 9.0-11.0. HslVU requires Mg2+ as a cofactor for peptidase activity. G. kaustophilus HslVU peptidase activity was strongly inhibited by lactacystin. While HslVU proteaz hydrolyze the casein in the presence of ATP weakly it can not hydrolyse the natural protein substrate MBP-SulA. HslU alone has a low ATP hyrolysis activity however HslV stimulated HslVU ATPase activity 4.8 fold. Also increasement of ATP and HslV induced HslVU ATP hydrolysis.