B. licheniformis ATCC 27811 kökenli rekombinant alfa-amilazın saflaştırılması ve nitelendirilmesi

Abstract

a-Amilazlar (a-l,4-glukan-4-glukanhidrolaz; EC 3.2.1.1) kalsiyum taşıyan ve endo-amilazlar enzim ailesine üye bir enzim grubudur. Dünya enzim pazarının % 30'unu oluşturan amilazlar, günümüzde şekerlendirme, tekstil, gıda, mayalama, damıtma, deterjan, kağıt ve yakıt alkol üretimi gibi birçok endüstriyel süreçte yaygın olarak kullanılmaktadır. Mikroorganizmalardan, bitkilere ve diğer yüksek organizasyonlu canlılara kadar birçok canlı türünde bulunan a-amilazlar; karbohidrat metabolizmasında önemli bir role sahiptirler. Son yıllarda, sıcaklığa dayanıklı a- amilazların endüstriyel uygulamalarda başarıyla kullanılmaları; yüksek sıcaklık, geniş pH aralıkları ve zor çevresel koşullarda aktivite gösterebilen, a-amilazlar üzerine yapılan çalışmaları arttırmıştır. Bu tez çalışmasında; Bacillus licheniformis ATCC 2781 1 kökenli rekombinant a'-amilazın üretimi, saflaştırılması ve nitelendirilmesi hedeflenmiştir. Rekombinant a -amilaz, amonyum sülfat çöktürmesi, Q-sefaroz FF anyon değiştirme ve Sefakril S-200 HR moleküler elek kolon kromatografilerinin kullanıldığı bir sistemle, başlangıç örneğine oranla % 13.4 verimle ve -653 kez saflaştırılmıştır. SDS-PAGE analizi bulgularına göre; rekombinant ct-amilazın moleküler ağırlığı yaklaşık 55 kDa olarak önerilmiştir. Yapılan zimogram analizinde, 55 kDa büyüklüğündeki banda karşı gelen kısımda, hidrolize uğrayan nişastanın san renkli bir bölge oluşturduğu gözlenmiştir. Rekombinant a-amilazı nitelendirme çalışmaları kapsamında optimum sıcaklık ve pF£ ile, sıcaklık ve pH kararlılıkları yönünden test edilmiştir. Enzimin en yüksek aktiviteyi 87 °C'ta gösterdiği ve 77 °C'ta, başlangıçtaki aktivitesinin % 98'ini bir saat boyunca koruduğu görülmüştür. En yüksek aktivite değeri pH, 7.0'da elde edilmiş, rekombinant a-amilazın pH 7.0-12 aralığında kararlı olduğu bulunmuştur. Metal iyonlarından, Ca+2, Mg+2, Mn+2 ve Na+, enzim aktivitesinde bir değişikliğe neden olmadığı halde, K+ ve Ba+2,un aktiviteyi arttırdığı belirlenmiştir. Düşük derişimdeki Al, Co, Ni ve Fe iyonlarının enzim aktivitesini hafifçe arttırmasına karşın, yüksek derişimler inhibisyona r iyonları kuvvetli inhibitörler olarak göze çarpmaktadır. arttırmasına karşın, yüksek derişimler inhibisyona neden olmakta, Cu+2 ve Zn+2İyonik ve iyonik olmayan deterjanlar ile yapılan testlerde, a-amilazın denenen tüm deterjanlara karşı dayanıklı olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, EDTA'nın enzimi inhibe ettiği, DTT ve P-merkaptoetanolün enzim aktivitesini arttırdığı, PMSF'in ise enzim aktivitesini etkilemediği belirlenmiştir. Gliserol ve DMSO'nun enzimin sıcaklık kararlılığım arttırdığı buna karşın, EG'ün azalttığı belirlenmiştir.In this study, we aimed to cultivate, purify and characterize recombinant alpha- amylase from Bacillus licheniformis ATCC 278 1 1, expressed in Bacillus subtilis. After a cultivation step, we purified recombinant a-amylase with a combination of Ammonium sulfate precipitation, Q-sepharose FF anion exchange and Sephacryl S-200 HR gel exclusion column chromatographies, ~ 653 fold with a yield of 13.4 %. In order to determine molecular mass of the enzyme, SDS-PAGE analysis was performed and the molecular mass of a-amylase is predicted as ~ 55 kDa. For characterization studies, the enzyme is tested for its optimal temperature and pH, besides its pH and thermo-stability. The optimum temperature and pH of the enzyme are found to be 87 °C and pH 7.0 respectively. The enzyme is determined to be resistant to 77 °C for one hour. The enzyme was stable between pH, 7.0 - 12.0. Besides, on the purified enzyme, effects of several metal ions, detergents and various chemicals which are known with their inhibitory, activatory or stabilizing effects were also tested. On the enzyme activity, there were no significant effect of the metal ions such i *y -X/y -4-0 -4- _- A-. 1 n as Ca, Mg, Mn and Na. But, it was shown that K and Ba are potent activators _^~ i T -4-0 t *) t o of the recombinant a-amylase. The metal ions, Al, Co, Ni and Fe which are known as heavy metals that increased the enzyme activity at low concentrations while their high levels showed inhibitory effect. Cu+2 and Zn+2 ions were found to be strong inhibitors of the enzyme. All the detergents tested have no significant denaturant effect on the a-amylase whereas EDTA is a strong inhibitor of the enzyme. Sulphydril reducing agents, DTT and (3-mercaptoethanol increased enzyme activity while PMSF had no significant activatory effect on the enzyme. DMSO which is an organic solvent, interestingly elevated the enzyme activity to % 580. It was shown that glycerol has a stabilizing effect on the enzyme, while EG decreased the activity.