Cloning, expression and characterization of the niger XYNB gene

Abstract

Aspergillus niger bitkisel kaynaklı ksilanları degrede etmeye yarayan ksilanazları hücre dışına salgılamaktadır. Çeşitli endüstriyel uygulamalarda kullanılan ksilanazlar, en çok mikroorganizmalar tarafından ve yine mikroorganizma kaynaklı ksilanaz genlerinin aktarıldığı suşlar kullanılarak üretilebilmektedir. Rekombinant yöntemlerle elde edilmiş suşlar ve enzimleri günümüzde tercih edilmektedir. Bu çalışmada, TÜBİTAK MAM kültür koleksiyonuna ait Aspergillus niger MRC200803 kodlu suştan, fonksiyonel ksilanaz B enzimini kodlayan xynB geni (UNENxynB2) homolog ve heterolog konakçı mikroorganizmalara aktarılmıştır. UNENxynB2 geni, kendi sinyali ile ve glaA promotoru kontrolünde, homolog olarak Aspergillus niger N593 suşu kromozomuna entegre edilmiştir. Üridin eklenmemiş ortamda seçilmiş toplam 17 transformantın 15'inin PCR pozitif olduğu tespit edilmiştir. UNENxynB2, AOX1 promotoru kontrolünde Pichia pastoris'e ait PHO1 ve S. cerevisiae'ye ait ?-faktör sinyal peptitleri ile heterolog olarak P. pastoris'e aktarılmıştır. His+ aday transformantlarının 84 tanesi PCR ile kontrol edilmiştir. 10 tane aday klonun xynB2 pozitif olduğu tespit edilmiştir. UNENxynB2 ekspresyonu, %0,5 metanol indüklemesi ile erlen kültürü yapılarak incelenmiştir. Çalışma sonucunda UNENxynB2 geninin ürünü olan ksilanaz B enzimi, P. pastoris konakçısında PHO1 sekresyon sinyali ile hücre dışına salınmıştır. GH10S-6 klonunda ekspresyona bağlı aktivite, buğday arabinoksilanı substrat olarak kullanıldığında 48. saatte 2 U/ml olarak ölçülmüştür. Erlen kültüründe sınırlı miktarda enzim salınmış ve ölçülen aktivitenin hızla düştüğü görülmüştür. P. pastoris'te ifadesi sağlanmış ham ksilanazın pH 5 ve 50 °C sıcaklıkta optimum aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Enzimin 50 °C'de 30 dakika inkübasyon sonunda aktivitesinin yalnızca %6'sı kalmaktadır. P. pastoris GS115'te ifade edilmiş olan UNENxynB2 geninin anlatımından elde edilen rekombinant ksilanaz enziminin fermentör boyutunda üretim çalışmalarına başlanması için yeterli verimlilikte olmadığı anlaşılmıştır.Aspergillus niger secretes xylanases, and degrade xylans of plant origin, outside the cell. Xylanases used in various industrial applications can be produced mostly by microorganisms and also by using strains from which microorganism-derived xylanase genes are transmitted. Strains and enzymes obtained by recombinant methods are currently preferred. In this study, xynB gene (UNENxynB2) encoding functional xylanase B enzyme was transferred from A.niger MRC200803 strain belonging to TUBITAK MRC fungal collection to homologous and heterologous host microorganisms. The UNENxynB2 gene is homologously integrated into the A.niger N593 chromosome under its own signal and control of the glaA promoter. 15 out of total of 17 transformants selected in uridine-free medium were found to be PCR positive. UNENxynB2 was heterologously transferred to P pastoris with the P.pastoris PHO1 and S.cerevisiae ?-factor signal peptides under the control of the AOX1 promoter. 84 of His+ candidate transformants were controlled by PCR. 10 candidate clones were identified as xynB2 positive. UNENxynB2 expression was examined by flask culture with 0.5% methanol induction. At the end of the study, xylanase B enzyme was released extracellularly by PHO1 secretion signal in P.pastoris host. Expression-dependent activity in clone GH10S-6 was measured at 2U/ml at 48h when wheat arabinoxylan was used as substrate. Limited amount of enzyme was released in flask culture and it was observed that measured activity decreased rapidly. Crude xylanase expressed in P.pastoris was found to have optimum activity at pH pH:5 and 50°C. After 30 minutes of incubation at 50°C, the enzyme retains only 6% of its activity. It was found that the recombinant xylanase enzyme obtained from the expression of UNENxynB2 gene expressed in P.pastoris GS115 was not efficient enough to start production studies in fermenter size.