EMT transkripsiyon faktörü ZEB2 ve hedef genlerinin nörogenezdeki rolü

Abstract

Nöroblastoma çocukluk çağında ortaya çıkan malignant karakterde bir tür solid tümördür ve temelinde embriyonik dönemdeki nörogelişim esnasında görülen farklılaşma mekanizmasındaki bozukluk yatmaktadır. Retinoik asit, birçok hücresel sinyal yolağı aracılığıyla hücre döngüsünde tutulmaya neden olmakta ve hücrelerin farklılaşmasını indüklemektedir. Nöroblastoma tedavisinde, retinoik asit tümör hücrelerinin nöronlara dönüştürülmesi amacıyla kullanılmaktadır. ZEB2 geni bağlantılı olduğu BMP/SMAD sinyal yolağı aracılığıyla farklılaşma mekanizması üzerinde rol oynamaktadır. SH-SY5Y hücrelerinin retinoik asit ile tetiklenen farklılaşma mekanizmasına dair gen/protein seviyesindeki bilgiler literatürde çok azdır. Retinoik asitle farklılaşması indüklenen SH-SY5Y hücrelerinde gerçekleşen moleküler değişimleri, ZEB2 geni ve ilişkili olduğu genler üzerinden incelemek ve ileri çalışmalara zemin hazırlamak bu tez çalışmasının amaçlarındandır. Bu amaçla, SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin nörojenik farklılaşması retinoik asitle indüklenmiştir. Farklılaşan hücrelerde, NF-H, TH, TUBB3 ve NEUN belirteçleri protein seviyesinde western blotlama yöntemiyle, GAP43, TUBB3, SYP ve MAPT belirteçleri gen ifadesi seviyesinde qRT-PCR yöntemiyle incelenmiştir. Ayrıca, farklılaşan hücrelerin mitokondri potansiyelleri TMRE boyaması ile belirlenmiştir. Tezin devamında, ZEB2 geninin nörojenik farklılaşmadaki rolünü incelemek amacıyla SH-SY5Y hücrelerinde ZEB2 ifadesi lentiviral shRNA kullanılarak baskılanmıştır. ZEB2 ifadesi kalımlı olarak baskılanan klonların farklılaşma potasiyelleri gen ve protein seviyesinde araştırılmıştır. Laboratuvarımızdaki ZEB2-ChIP-seq listesinden farklılaşma, gelişim/morfogenez, hücre iskeleti, hücresel sinyal iletimi, çoğalma/hücre döngüsü ve apoptoz/hücresel sağkalım ile ilişkili ZEB2 bağımlı değişen genler belirlenmiştir. Sonuç olarak, ZEB2 bağımlı olarak ifadesi değişen genlerin nöral farklılaşma sırasındaki değişimleri incelenmiştir. Böylece, ZEB2 ve ilişkili olduğu genlerin nörojenik farklılaşma mekanizmasındaki rolüne dair literatüre moleküler bilgi katkısı yapılmıştır.Neuroblastoma is malignant solid tumor occuring in childhood and based on defect in differentiation observed during neurodevelopment in embryonic period. Retinoic acid causes arrest in cell cycle through cellular pathways and induces differentiation. In the treatment of neuroblastoma, retinoic acid is used to transform tumor cells into neurons. ZEB2 gene plays role in differentiation mechanism through BMP/SMAD pathway. There is little information at gene/protein level on SH-SY5Y cells' differentiation mechanism triggered by retinoic acid. One of this thesis' aims is to examine molecular changes in SH-SY5Y cells induced by retinoic acid through ZEB2 gene and its related genes and to lay groundwork for further studies. For this purpose, SH-SY5Y cells' neurogenic differentiation was induced by retinoic acid. In differentiated cells, NF-H, TH, TUBB3 and NEUN markers were investigated at protein level by western blotting method, GAP43, TUBB3, SYP and MAPT markers at gene expression level by qRT-PCR method. In addition, differentiated cells' mitochondrial potentials were determined by TMRE staining. In continuation of thesis, to examine ZEB2 gene' role in neurogenic differentiation, SH-SY5Y cells' ZEB2 expression was suppressed using lentiviral shRNA. Differentiation potentials of clones whose ZEB2 expression was permanently suppressed was investigated at gene/protein level. ZEB2-dependent varying genes associated with differentiation, developmental/morphogenesis, cytoskeleton, cellular signal transduction, proliferation/cell cycle and apoptosis/cellular survival were identified from the ZEB2-ChIP-seq list in our laboratory. As a result, during neural differentiation, changes of genes whose expression is changed depending on ZEB2 were investigated. Thus, molecular information has been contributed to literature on ZEB2's role and its related genes in neurogenic differentiation.