Rekombinant bacillus thuringiensis suşları ile büyük ölçekli insektisit üretimi ve yerli izolatların sivrisinek larvaları üzerindeki toksik etkisinin değerlendirilmesi

Abstract

ÖZET

Bacillus thuringiensis israelensis (Bti), sivrisinek ve karasinek larvalarına karşı etkili, çevre dostu bir biyopestisit olarak yaygın şekilde kullanılmaktadır. Bti, hedef larvaların sindirim sistemini bozan Cry ve Cyt proteinlerinden oluşan parasporal kristaller üretir. Özellikle Cry4A, Cry4B, Cry11A ve Cyt1A proteinleri, Diptera türlerine karşı yüksek toksisite göstermektedir. Polifosfat (poliP), enerji depolama ve stres yanıtı gibi temel hücresel süreçlerde görev alan bir polimerdir ve polifosfat kinaz (PPK) enzimi tarafından sentezlenir. Laboratuvarımızda daha önce gerçekleştirilen çalışmalarda, ppk genini yüksek düzeyde ifade eden Bti pHT315ppk suşu ve genin silinmesiyle elde edilen Bti Δppk suşunun yaban suşa göre daha fazla δ-endotoksin ürettiği gözlenmiştir. Laboratuvarımızda oluşturulan bir diğer rekombinant suş olan Bti pHT315lon, hücresel homeostazın korunmasında görevli ve çeşitli fizyolojik süreçlerde rol alan önemli bir enzim olan Lon proteazı yüksek seviyede ifade etmektedir. Bu tez çalışmasında, rekombinant suşların δ-endotoksin üretim kapasitelerinin karşılaştırılması, yüksek üretici suşun seçilerek optimum koşulların belirlenmesi ve büyük ölçekli üretime geçiş için ön denemelerin yapılması amaçlanmıştır. Bunun yanında sivrisinek larvalarını öldürebilen potansiyel Bacillus thuringiensis suşlarının izole edilmesi de çalışmaya dahil edilmiştir. Rekombinant suşlar arasında en yüksek üretim kapasitesine sahip suş Bti Δppk olarak belirlenmiş ve bu suşun δ-endotoksin üretimini artıran kültür koşulları DSM besiyerinde optimize edilmiştir. En yüksek üretimin 25 °C, pH 8.0 koşullarında ve ve nişasta içeren besiyerinde gerçekleştiği belirlenmiştir. Ayrıca, Bti Δppk suşunun sadece yüksek düzeyde endotoksin üretmediği aynı zamanda yaban tipe kıyasla daha hızlı büyüdüğü ve daha yüksek sporlanma verimi gösterdiği saptanmıştır. 2. ve 3. evre Culex pipiens larvaları üzerinde gerçekleştirilen toksisite analizlerinde ise, Bti Δppk suşu için LC₅₀ değeri 5,9 ± 2,0 ng/ml ve LC₉₀ değeri 45,8 ± 22,8 ng/ml olarak belirlenmiş ve rekombinant suşun yaban suşa göre daha yüksek larvasidal aktiviteye sahip olduğu bulunmuştur. Büyük ölçekli üretim, 2 L’lik fermentörde gerçekleştirilmiş, kristal protein veriminin laboratuvar ölçeğine göre düşük olduğu gözlendiğinden, gelecek çalışmalarda değişkenlerin fermentör ortamı için tekrar optimize edilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Tez kapsamında ayrıca farklı ölü böcek örneklerinden 8 tane Bacillus thuringiensis benzeri suş izole edilmiş ve izolatların morfolojik, biyokimyasal ve toksikolojik özellikleri değerlendirilmiştir. Culex pipiens larvalarıyla yapılan biyoassay sonuçları, izolatların 5 tanesinin potansiyel biyoinsektisid adayı olduğunu göstermiştir. Toksisitesi yüksek doğal izolatların rekombinant suşlarla kombinasyonu yoluyla etkinliği artırılmış biyoinsektisid karışımların hazırlanması için ön verilerin toplandığı bu çalışma, Bti suşlarından etkili bir biyopestisit elde edilmesi için hem genetik çalışmaların hem de doğal izolatların önemini ortaya koymaktadır. Anahtar Kelimeler: Bacillus thuringiensis, Polifosfat kinaz, Lon proteaz, Biyoinsektisit, Büyük ölçekli üretim

ABSTRACT

Bacillus thuringiensis israelensis (Bti) is widely used as an environmentally friendly biopesticide effective against mosquito and housefly larvae. Bti produces parasporal crystals composed of Cry and Cyt proteins that disrupt the digestive system of target larvae. Among these, Cry4A, Cry4B, Cry11A, and Cyt1A proteins exhibit high toxicity against Dipteran species. Polyphosphate (polyP) is a polymer involved in fundamental cellular processes such as energy storage and stress response, and it is synthesized by the enzyme polyphosphate kinase (PPK). In our previous studies, the Bti pHT315ppk strain, which overexpresses the ppk gene, and the Bti Δppk strain, in which the gene was deleted, were observed to produce higher levels of δ-endotoxin compared to the wild type. Another recombinant strain constructed in our laboratory, Bti pHT315lon, expresses the Lon protease gene, an enzyme responsible for maintaining cellular homeostasis and involved in various physiological processes. This thesis aims to compare the δ-endotoxin production capacities of recombinant strains, select the high-crystal producing strain and determine the optimal conditions, and conduct preliminary trials for transition to large-scale production. Furthermore, the study incorporates the isolation of potential Bacillus thuringiensis strains, which have the capacity to kill mosquito larvae. Among the recombinant strains, Bti Δppk was identified as the highest δ-endotoxin producer, and the culture conditions enhancing toxin production were optimized in DSM medium. It has been determined that the highest production occurs at 25 °C, pH 8.0 conditions, and in a starch-containing medium. Furthermore, it was determined that the Bti Δppk strain not only produces elevated levels of endotoxin but also exhibits accelerated growth and higher sporulation yield in comparison to the wild type. Toxicity analyses performed on second and third-instar Culex pipiens larvae revealed LC₅₀ and LC₉₀ values of 5.9 ± 2.0 ng/ml and 45.8 ± 22.8 ng/ml, respectively, indicating that the recombinant strain had higher larvicidal activity than the wild type. Large scale production was carried out in a 2 L fermenter, and since the yield was lower compared to the laboratory scale, it was concluded that further optimization of the fermentation parameters is required for future studies. Within the scope of the thesis, 8 Bacillus thuringiensis-like strains were also isolated from different dead insect samples, and their morphological, biochemical, and toxicological characteristics were evaluated. Bioassay results conducted with Culex pipiens larvae showed that 5 isolates are potential bioinsecticide candidates. This study, which collected preliminary data for the preparation of bioinsecticide mixtures with enhanced efficacy through the combination of toxic natural isolates with recombinant strains, underscores the significance of both genetic studies and natural isolates for the effective biopesticide development from Bti strains. Keywords: Bacillus thuringiensis, Polyphosphate kinase, Lon protease, Bioinsecticide, Large scale production