The network between polyp, lon protease and secondary metabolite production in Streptomyces coelicolor A3(2)

Abstract

The bacterial stringent response is a global regulatory process that can be triggered by amino acid deprivation or energy limitation. Guanosine tetra- and penta-phosphates (ppGpp and pppGpp), also known as alarmones, are the effector molecules of the stringent response. The RelA is primarily responsible for producing these alarmones, with some contribution from the SpoT. An increase in alarmone concentration results in the accumulation of polyP, which is an inorganic phosphate polymer synthesized by polyphosphate kinase (PPK). In Escherichia coli, this polymer forms a complex with the ATP-dependent Lon protease under stringent conditions. The complex is involved in the degradation of ribosomal proteins to obtain the amino acid pool. Previous studies have shown that overexpression of the lon gene and deletion of the ppk gene significantly increased actinorhodin (ACT) production in Streptomyces coelicolor A3(2) (SCO). In this study, we simulated a recombinant SCO?ppk-lon cell expressing the extra lon gene in ppk-deficient strain using a modified in silico model, ecSco-GEM. The results have confirmed the negative effect of PPK on actinorhodin production. The ensemble modelling results have indicated that NADH dehydrogenase/complex-I, Beta-ketoacyl-[acyl-carrier-protein] synthase III, glycine cleavage system and superoxide dismutase are enzymes that have a positive role in ACT production. The in silico results were validated by in vitro experiments. lon gene was integrated into the genome of SCO?ppk strain and antibiotic production was determined. It is important to note that overexpression of lon converted the wild-type strain into a hyper-antibiotic producer, but this effect was not observed in the SCO?ppk strain, demonstrating the significance of PPK in cellular metabolism. The accuracy of the ensemble modelling results was verified by measuring superoxide dismutase activity. This study suggests that GEMs can be a reliable starting point for in vitro studies of Streptomyces.Sınırlandırılmış (stringent) cevap, amino asit açığı veya enerji eksikliği ile tetiklenebilen global bir düzenleyici süreçtir. Alarmonlar olarak da bilinen guanozin tetra- ve penta-fosfatlar (ppGpp and pppGpp), sınırlandırılmış cevabın efektör molekülleridir. RelA ve SpoT proteinleri bu alarmonların üretilmesinden birincil olarak sorumludur. Alarmon konsantrasyonundaki artış, polifosfat kinaz (PPK) enzimi tarafından sentezlenen inorganik bir fosfat polimeri olan polifosfatın (poliP) birikmesine neden olur. Escherichia coli'de sınırlandırılmış cevap koşullarında bu polimer, ATP'ye bağlı Lon proteaz ile bir kompleks oluşturur. Bu kompleks, eksik olan amino asit havuzunu doldurmak için var olan ribozomal proteinlerin parçalanmasında rol oynar. Önceki çalışmalar, lon geninin aşırı ekspresyonunun ve ppk geninin silinmesinin Streptomyces coelicolor A3(2)'de (SCO) aktinorhodin (ACT) üretimini önemli ölçüde artırdığını göstermiştir. Bu çalışmada, modifiye edilmiş bir in silico model olan ecSco-GEM kullanarak ppk geni silinmiş olan hücrelerde lon genini fazla ifade eden rekombinant SCO?ppk-lon hücresi simüle edilmiş ve PPK'nın aktinorhodin üretimi üzerindeki olumsuz etkisi doğrulamıştır. Ensemble modelleme sonuçları ise, NADH dehidrojenaz/kompleks-I, Beta-ketoasil-[açil-taşıyıcı-protein] sentaz III, glisin parçalama sistemi ve süperoksit dismutazın ACT üretiminde olumlu rolü olan enzimler olduğunu göstermiştir. In silico sonuçlar in vitro deneylerle doğrulanmıştır. lon geni SCO?ppk suşunun genomuna entegre edilmiş ve antibiyotik üretimi ölçülmüştür. İlginç bir şekilde lon'un aşırı ekspresyonu vahşi tip suşu hiper-antibiyotik üreticisine dönüştürürken, bu etki SCO?ppk suşunda gözlenmemiştir. Bu da PPK'nın hücresel metabolizmadaki önemini göstermektedir. Ensemble modelleme sonuçlarının doğruluğu ise süperoksit dismutaz aktivitesi ölçümüyle gerçekleştirilmiştir. Bu çalışma, GEM'lerin Streptomyces'in in vitro çalışmaları için güvenilir bir başlangıç noktası olabileceğini göstermektedir.