Yeni MBD2 inhibitör adaylarının in vitro sitotoksik etkilerinin araştırılması

Abstract

Önemli ve çok yönlü bir epigenetik düzenleyici olan Methyl-CpG-binding Domain Protein 2 (MBD2)'nin, pluripotensi, hücre çoğalması, bazı bağışıklık hücrelerinin olgunlaşması, glikolitik yolak vb. birçok hücresel mekanizmada ve kanser başta olmak üzere bazı hastalıklarda rol oynadığı bildirilmiştir. MBD2'nin farklı hücre tiplerindeki (kök hücre, somatik hücre vb.) düzenleyici rolüne ve kanserde terapötik hedef olma potansiyeline rağmen şimdiye kadar tanımlanmış tek kimyasal inhibitörü KCC-07'dir. Bu tez kapsamında, daha önce in silico yöntemlerle tanımlanan ve MBD2'nin metillenmiş DNA-bağlanma domenini hedef alan aday inhibitörlerin, sağlıklı (HFF-1) ve farklı kanser hücre hatlarındaki (HUH-7, U-2 OS, PC-3, MCF-7) sitotoksik etkileri araştırılmıştır. Bu küçük kimyasal moleküllerin hücre canlılıklarına etkisi, WST-1 proliferasyon deneyi ve akım sitometrisi (Annexin V boyama) kullanılarak, KCC-07 ile karşılaştırmalı olarak analiz edilmiştir. Elde edilen sonuçlar, Bileşik 1 ve Bileşik 3'ün hücreler üzerinde anlamlı bir sitotoksik etkiye sahip olmadığını ortaya koymuştur. Buna karşın, bir diğer aday olan Bileşik 2; HUH-7, U2-OS ve MCF-7 gibi agresif veya metastatik karaktere sahip kanser hatlarının proliferasyonu ve canlılığı üzerinde %95'e varan inhibisyon sağlamıştır. Ayrıca, tüm kanser hücre hatlarında bu aday molekül için hesaplanan LC50 değerlerinin, KCC-07 için hesaplanan değerlere oranla 7 kata kadar daha düşük olduğu saptandı. Kısacası; Bileşik 2, KCC-07'ye görece daha düşük doz ve daha kısa sürelerde, daha etkili bir sitotoksisite sergilemiştir. Değerlendirmelerimize göre kimyasal moleküllere en dirençli (PC-3) ve en hassas (HUH-7) kanser hatları ile HFF-1 hücre hattında, büyüme eğrilerinde görülen düşüşün nedeni araştırılmıştır. HFF-1 ve PC-3 hücrelerinde KCC-07 ve Bileşik 2'nin genel itibariyle apoptoza neden olduğu fakat bu moleküller varlığında HUH-7 hücrelerindeki ölümün nekrozdan kaynaklandığı tespit edilmiştir. Sonuçta; bu tez, tarafımızdan sentezlenen üç orijinal kimyasal molekülün hücreler üzerindeki sitotoksik etkilerine dair ilk bulguları raporlamıştır. İkinci olarak çalışmamız, literatürde yalnızca medulloblastomda çalışılmış KCC-07'nin farklı kanser hatlarındaki sitotoksik etkilerini ilk defa kapsamlı olarak inceleyen bir nevi "KCC-07 kanser paneli" ortaya koymuştur. Böylece, bahsedilen iki önemli özgün yönü ile bu tez, epigenetik ilaç olma potansiyeline sahip yeni MBD2 inhibitör adaylarının fonksiyonel etkilerinin incelendiği araştırma projesi (TÜSEB 2022-B-02-22387) kapsamındaki ilk bulguları bize kazandırmıştır.Methyl-CpG-binding Domain Protein 2 (MBD2) is a crucial and multifaceted epigenetic regulator implicated in various cellular processes, including pluripotency, cell proliferation, the maturation of certain immune cells, glycolytic pathways, and several diseases, particularly cancer. Despite its regulatory role in different cell types (e.g., stem cells, somatic cells) and its potential as a therapeutic target in cancer, KCC-07 remains the only chemically identified inhibitor of MBD2 to date. In this thesis, the cytotoxic effects of candidate inhibitors—previously identified through in silico approaches and targeting the methylated DNA-binding domain of MBD2—were investigated in healthy (HFF-1) and various cancer cell lines (HUH-7, U-2 OS, PC-3, MCF-7). The impact of these small chemical molecules on cell viability was comparatively analyzed with KCC-07 using the WST-1 proliferation assay and flow cytometry (Annexin V staining). The results demonstrated that Compound 1 and Compound 3 did not exhibit significant cytotoxic effects on the tested cell lines. In contrast, Compound 2 inhibited the proliferation and viability of aggressive or metastatic cancer cell lines such as HUH-7, U2-OS, and MCF-7 by up to 95%. Moreover, the LC50 values for this candidate molecule in all cancer cell lines were up to seven times lower than those calculated for KCC-07. Briefly, Compound 2 exhibited more effective cytotoxicity than KCC-07 at lower doses and shorter exposure times. Then, we sought the reason for the decline in growth curves in the most resistant (PC-3) and most sensitive (HUH-7) cancer lines and the HFF-1 cell line to the chemical molecules according to our findings. It was determined that KCC-07 and Compound 2 mainly caused apoptosis in HFF-1 and PC-3 cells, but the death of HUH-7 cells in the presence of these molecules resulted from necrosis. In conclusion, this thesis reports the first findings on the cytotoxic effects of three newly synthesized original chemical molecules. Secondly, our study provides a comprehensive "KCC-07 cancer panel" by systematically evaluating the cytotoxic effects of KCC-07—previously studied only in medulloblastoma— across different cancer cell lines. With its two defined specific aspects, this thesis has given us the preliminary insights of an ongoing research project (supported by TÜSEB 2022-B-02-22387), which investigates the functional effects of novel MBD2 inhibitor candidates with potential epigenetic therapeutic applications.