Cloning α-amylase from Priestia megaterium: Heterologous expression optimization and scale-up

Abstract

Mikrobiyal enzimlerden özellikle ?-amilazlar, stabiliteleri ve üretim kolaylıkları nedeniyle unculuktaki endüstriyel uygulama potansiyelleri açısından dikkat çekmektedir. Endüstriyel olarak ?-amilaz, çoğunlukla vahşi tip mikroorganizmalardan Bacillus subtilis ve Bacillus licheniformis ile üretilmiştir. Özellikle son yıllarda geleneksel olmayan maya Pichia pastoris (Komagataella phaffii) ve en popüler bakteri olan Escherichia coli, büyük ölçekli üretime yönelik rekombinant protein üretimindeki potansiyelleriyle öne çıkmaktadır. Ancak ölçek büyütme süreci, başarılı bir ölçeklendirme elde etmek için titiz bir yaklaşım gerektiren karmaşık biyolojik, kimyasal ve fiziksel faktörleri gerektirir. Bu çalışma, Priestia megaterium ?-amilazının (PmAmy) üretimini, rekombinant P. pastoris (CBS 7435) ve E. coli (BL-21) konak hücrelerinde gerçekleştirmeyi ve büyük ölçekte büyüme koşullarının iyileştirilmesini amaçlamaktadır. P. pastoris transformasyon sonrası 8 adet pAOX1 promotorlu rekombinant suşları küçük ölçekte yüksek verimli tarama yöntemi ile değerlendirilmiş ve bu denemeler sonucu seçilen pPICZ?A-2 straini ile fermantasyon denemeleri gerçekleştirilmiştir. Fermantasyonlarda 2.3±1.6 Uıml-1 ?-amilaz enzim aktivitesi elde edilmiştir Öte yandan PmAmy ticari olarak pET28 b(+)'da klonlandı ve E. coli BL21'de ifade edildi. Küçük ölçekte yüksek verimli tarama yöntemi kullanılarak; optimum ortam koşulları ve IPTG'nin (İzopropil ?-D-1-tiogalaktopiranosid) protein ifadesi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Gerçekleştirilen biyoreaktör çalışmaları ile biyokütle artışına bağlı olarak IPTG indükleme konsantrasyonu optimize edilmiş ve iyileştirilmiş ortam koşulları 1 vvm hava, 37°C sıcaklık ve 1000 rpm'de 22 gbiomassımmolIPTG-1 oranı olarak belirlenmiştir. Bu ortamda gerçekleştirilen biyoproses işlemi sonucunda 22.3±5.3 g L-1 hücre konsantrasyonunda 67.7±4.0 Uıml-1 ?-amilaz enzim aktivitesi elde edilmiştir. Aday enzimin endüstrideki verimliliğini değerlendirmek için, saflaştırılmış PmAmy, ticari enzimle (Fungamyl 2500 Novozymes, Danimarka) karşılaştırılarak ekmek çalışmaları ile fırıncılık endüstrisi için potansiyeli değerlendirilmiştir. Genel olarak bu çalışma, PmAmy barındırılan rekombinant P. pastoris ve E. coli suşları için biyoreaktör optimizasyonunun sonuçlarını ve fırıncılık endüstrisindeki potansiyelini ortaya koymuştur.Among microbial enzymes, ?-amylases are particularly noteworthy for their potential industrial applications in the flour milling industry due to their stability and ease of production. Industrially, ?-amylase has mostly been produced with wild-type microorganisms such as Bacillus subtilis and Bacillus licheniformis. Recently, non-conventional yeast strain Pichia pastoris (Komagataella phaffii) and the most popular bacteria Escherichia coli have emerged for large-scale recombinant protein production due to their industrial potential like high cell density fermentation, acquiring cheap media components, easy manipulation and having a diversity of promoters. However, there are some bottlenecks in scaling-up the process. Increase in scale requires a meticulous approach to address the complex biological, chemical, and physical factors for successful scaling. This study aims to produce Priestia megaterium ?-amylase (PmAmy) in recombinant P. pastoris (CBS 7435) and E. coli (BL-21) host cells and to optimize growth conditions at a large scale. After transformation, 8 pAOX1 promoter-based recombinant strains of P. pastoris were evaluated with a small-scale high-throughput screening method. Fermentations yielded ?-amylase enzyme activity of 2.3±1.6 Uıml-1. Additionally, PmAmy was commercially cloned into pET28 b(+) and expressed in E. coli BL21. Using a high-throughput screening method on a small scale, the optimal medium conditions and the effect of IPTG (Isopropyl ?-D-1-thiogalactopyranoside) on protein expression were investigated. The bioreactor studies optimized the IPTG induction concentration based on biomass increase. The improved conditions were determined to be 1 vvm air, 37°C, and 1000 rpm with a ratio of 22 gbiomassımmolIPTG-1. Under these conditions, the bioprocess yielded an ?-amylase enzyme activity of 67.7±4.0 Uıml-1 at a cell concentration of 22.3±5.3 gıL-1. To evaluate the efficiency of the candidate enzyme in the industry, purified PmAmy was compared with a commercial enzyme (Fungamyl 2500 Novozymes, Denmark) through baking trials to assess its potential for the baking industry. Overall, this study demonstrated the results of bioreactor optimization for recombinant P. pastoris and E. coli strains harboring PmAmy and highlighted its potential in the baking industry.