Heterologous expression of novel L-alanine dehydrogenases and generation of mutants for the synthesis of unnatural amino acids

Abstract

Tez çalışması L-alanin türevlerinden yapay amino asitlerin asimetrik sentezi için yeni bir NAD(H)-bağımlı L-alanin dehidrogenaz (L-AlaDH) enzim tasarımı, karakterizasyonu, protein mühendisliği ve modellemesi üzerine odaklanmaktadır. Farklı organizmalardan seçilen L-AlaDH enzimlerinin ifadesi, saflaştırılması ve aktiviteleri kapsamlı bir şekilde incelenmiştir. En yüksek katalitik verimliliğe sahip enzimleri seçmek için optimum pH, sıcaklık ve kinetik değerler gibi önemli parametreler belirlenmiştir. Pirüvat türevlerine (?-ketovalerat, ?-ketobütriyat ve ?-ketokaproat) karşı enzim aktivitesini artırmak amacıyla mutasyon çalışmaları yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar kapsamında, L-AlaDH enzimlerinin çalışma kapsamında kullanılan ketoasitlere karşı aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Özellikle, Thermus thermophilus (TtAlaDH) kaynaklı L-AlaDH enzimi, tüm test edilen substratlar karşısında yüksek katalitik verimlilik ve spesifik aktivite sergileyerek, protein mühendisliği için umut verici bir adaylar olarak görülmüştür. Tyr92 ve Tyr115 pozisyonlarına yapılan mutasyonel analizlere göre, Ser92 mutantının enzim aktivitesinin ?-ketovalerat ve ?-ketokaproata karşı etkinliğini artırdığını, ancak ?-ketobütriyata karşı etkinliğini kaybettiğini göstermiştir. ?-ketokaproat için, kcat 99-kat artmış, KM 26-kat artmış ve bu da katalitik verimliliğin 6-kat artmasına yol açmıştır. ?-ketovalerat için, kcat 2.2-kat artmış ve KM 1.8-kat artmış, bu da katalitik verimliliğin 2-kat artmasına yol açmıştır. Ancak, ?-ketobütriyat için, kcat 18-kat azalmış ve KM 8-kat artmış, bu da katalitik verimliliğin 150-kat azalmasına neden olmuştur. Ser92 mutantındaki ikinci bir mutasyon, Met115 pozisyonunda, enzim aktivitesini önemli ölçüde artırmış ve ?-ketokaproat karşısındaki performansını iyileştirmiş, ancak ?-ketovalerat karşısındaki etkinliğini azaltmış ve ?-ketobütriyat karşısında önemli bir değişiklik göstermemiştir. ?-ketokaproat açısından, katalitik aktivite, hem yabanıl tip enzimiyle hem de Tyr92Ser mutantıyla karşılaştırıldığında önemli ölçüde artmıştır. kcat, yabanıl tipe göre 155-kat artmış, KM 37-kat artmış ve bu da katalitik verimliliğin 4-kat artmasına yol açmıştır. Tyr92Ser ile karşılaştırıldığında, kcat 1.5-kat artmış ve KM 1.4-kat artmış, bu da 1.2-katlık bir iyileşmeye neden olmuştur. Ancak, ?-ketovalerat için, katalitik aktivite hem yabanıl tip hem de Tyr92Ser mutantları ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde azalmıştır. kcat yabanıl tipe göre 4-kat azalmış ve KM 5-kat artmış, bu da katalitik verimliliğin 20-kat azalmasına yol açmıştır. Tyr92Ser ile karşılaştırıldığında, kcat 8.2-kat azalmış ve KM 4-kat artmış, bu da 33.5 katlık bir azalmaya yol açmıştır. ?-ketobütriyat için, katalitik aktivitede belirgin bir azalma gözlemlenmiştir. kcat yabanıl tipe göre 6.5-kat azalmış ve KM 49-kat artmış, bu da verimliliğin 375-kat azalmasına neden olmuştur. Tyr92Ser ile karşılaştırıldığında, kcat 2.8-kat artmış, ancak KM 6.2-kat artmış, bu da aktivitenin toplamda 2.5-kat azalmasına yol açmıştır. Sonuç olarak, Tyr115Met mutasyonu ?-ketokaproat karşısındaki katalitik aktiviteyi artırmış, ancak ?-ketovalerat ve ?-ketobütriyat karşısındaki etkinliği önemli ölçüde azaltmıştır. L-AlaDH enzimlerinin yapı-fonksiyon ilişkisini anlamak, gelişmiş özelliklere sahip yeni enzimlerin geliştirilmesine olanak sağlayarak biyokimya, gıda ve ilaç endüstrilerinde çeşitli endüstriyel uygulamalar için değerli hale getirebilir.This thesis focuses on design, characterization, protein engineering, and modeling an NAD(H)-dependent L-alanine dehydrogenase (L-AlaDH) for asymmetric amino acid synthesis. It examines enzyme expression, purification, and activity, identifying key parameters for optimal catalytic efficiency. Mutagenesis studies aimed to enhance enzyme activity against specific pyruvate derivatives, including ?-ketovalerate, ?-ketobutyrate, and ?-ketocaproate. The results indicate that L-AlaDH enzymes are active against these ketoacids. In particular, the L-AlaDH enzyme from Thermus thermophilus (TtAlaDH) demonstrated high catalytic efficiency and specific activity against all tested substrates, positioning it as a promising candidate for protein engineering. Mutational analysis of the Tyr92 and Tyr115 positions showed that the Ser92 mutant notably enhanced enzyme activity and effectiveness against ?-ketovalerate and ?-ketocaproate, though it lost effectiveness against ?-ketobutyrate. For ?-ketocaproate, the kcat increased 99-fold, while KM increased 26-fold, yielding a 6-fold improvement in catalytic efficiency. For ?-ketovalerate, the kcat increased 2.2-fold, and KM increased 1.8-fold, leading to a 2-fold increase in catalytic efficiency. However, for ?-ketobutyrate, the kcat decreased 18-fold, and KM increased eight-fold, resulting in a 150-fold reduction in catalytic efficiency. A second mutation at the Met115 position in the Ser92 mutant significantly boosted enzyme activity and improved its performance against ?-ketocaproate, while reducing effectiveness against ?-ketovalerate and showing little change against ?-ketobutyrate. In terms of ?-ketocaproate, catalytic activity increased substantially compared to both the wild-type enzyme and the Tyr92Ser mutant. The kcat increased 155-fold over the wild type, while KM increased 37-fold, resulting in a 4-fold improvement in catalytic efficiency. Compared to Tyr92Ser, the kcat increased 1.5-fold, and the KM increased 1.4-fold, resulting in a 1.2-fold improvement. For ?-ketovalerate, however, catalytic activity decreased significantly compared to both the wild-type and Tyr92Ser mutants. The kcat decreased 4-fold, and KM increased 5-fold compared to the wild type, leading to a 20-fold reduction in catalytic efficiency. Compared to Tyr92Ser, the kcat decreased 8.2-fold, and KM increased 4-fold, resulting in a 33.5-fold decrease. For ?-ketobutyrate, a notable reduction in catalytic activity was observed. The kcat decreased 6.5-fold, and KM increased 49-fold over the wild type, leading to a 375-fold decrease in efficiency. Compared to Tyr92Ser, the kcat increased 2.8-fold, but KM increased 6.2-fold, resulting in a 2.5-fold reduction in activity. These findings highlight the impact of specific mutations on L-AlaDH activity and substrate specificity. Understanding the structure-function relationships of these enzymes enables the design of biocatalysts with enhanced properties for industrial applications. Engineered L-AlaDH enzymes have potential in biochemistry, food processing, and pharmaceutical production, facilitating the creation of novel drugs, nutritional supplements, and other high-value products. This contributes to sustainable and innovative solutions across various sectors.