CRISPR/CAS9 sistemi kullanılarak domates (Solanum lycopercium) bitkisinde CCDC124 geninin susturulması

Abstract

Mayalardan insana kadar tüm ökaryotlarda korunmuş olarak bulunan Ccdc124 (Coiled-coil domain containing 124) proteini, RNA-bağlayıcı bir proteindir ve hücre içerisinde ribozomda ve sentrozomda bulunduğu gösterilmiştir. Daha önceki çalışmalarda Ccdc124 proteinini kodlayan genin memeli hücre hatlarında susturulması ve aşırı ifade edilmesi durumlarında sitokinezde bozulmaların meydana geldiği ve çok çekirdekli hücrelerin oluştuğu tespit edilmiştir. Fakat hücre bölünmesi ve hücre içindeki diğer fizyolojik olaylarda nasıl bir rol oynadığı hala bilinmemektedir. CCDC124 geninin domates bitkisindeki homoloğu üzerinde, CRISPR/cas9 sistemi kullanılarak yapılan bu çalışma ile CCDC124 geni susturulmasıyla bitkilerde ne gibi morfolojik farklılıkların olduğu tespit edilerek genin fonksiyonunun araştırılması amaçlanmıştır. Ayrıca bu çalışma, CCDC124 geninin bitkilerdeki homoloğu üzerinde yapılan ilk çalışma olmakla birlikte, bitkilerde CCDC124 ifadesi olmadığında organizma boyutunda ne gibi fenotipik etkilerin olduğunu gösteren ilk çalışmadır. Bu tez çalışmasının ilk basamağında, kılavuz RNA'lar (gRNA'lar) CCDC124 geninin birinci ekzonunu hedef alacak şekilde tasarlanmış, ardından Golden Gate klonlama ile pYLCRISPR/Cas9P35S-N vektörüne klonlanmıştır. Daha sonra, domates bitkisine Agrobacterium aracılı kararlı transformasyonu gerçekleştirilmiştir. Transgenik bitki hatlarının PZR tabanlı belirlenmesinden sonra hedeflenen bölgede oluşan mutasyonlar dizi analizleri ile doğrulanmıştır. Çalışmamızın sonucunda, SlCCDC124 mutantlarında farklı uzunlukta delesyonların ve baz değişimlerinin olduğu belirlenmiştir. Ayrıca, SICCDC124 mutantlarının, yabanil tip bitkilerle karşılaştırıldığında belirgin morfolojik farklılıklara sahip olduğunu ve mutant bitki hatlarında erken yaşlanma gerçekleştiği gözlemlenmiştir.

Ccdc124 (Coiled-coil domain containing 124) protein, which is conserved in all eukaryotes from yeast to human, is an RNA-binding protein and has been shown to be found in the ribosome and centrosome in the cell. Previous investigations have shown that overexpression and silencing of the CCDC124 gene in mammalian cell lines lead to cytokinesis being disrupted and the formation of multinucleated cells. However, it is still unclear how it affects cell division and other physiological processes taking place inside the cell. The aim of this study, which was carried out on the homolog of the CCDC124 gene in tomato plants, using the CRISPR/cas9, was to determine the morphological differences in plants by silencing the CCDC124 gene and to investigate its function. Additionally, this study is the first to examine the CCDC124 gene's plant homolog and indicate the phenotypic impacts of organism size in the absence of CCDC124 expression in plants, In the first step of this thesis, guide RNAs were designed to target the first exon of the CCDC124 gene, then cloned into the pYLCRISPR/Cas9P35S-N vector by Golden Gate cloning. Subsequently, Agrobacterium-mediated stable transformation of tomato plant was carried out. Sequence analysis was used to confirm mutations in the targeted region after PCR-based transgenic plant line identification. As a consequence of our research, it was determined that SlCCDC124 mutants had deletions of various lengths and base changes. Additionally, it was observed that SICCDC124 mutants have significant morphological differences compared to wild-type plants and premature senescence occurs in mutant plant lines.