Optimization of the production process and purification of SARS-CoV-2 S1 protein using SUMO fusion tag and DSBC leader peptide

Abstract

SARS-CoV-2 pandemi haline gelmiş olan Covid-19 hastalığına sebep olan Coronaviridae ailesinin en yeni üyesidir. Covid-19 dünya genelinde ölümlere sebep olmakla birlikte bu hastalığı geçirmiş olan kişilerde yıllar içerisinde kalıcı hasarlar bıraktığı belirlenmiştir. Bu sebepler hem Covid-19 tedavisi hem de aşı çalışmalarının önemini göstermektedir. Bu tez kapsamında, bahsedilen çalışmalarda da kullanılmak üzere SARS-CoV-2 Spike proteininin alt birimi olan S1 proteinin, rekombinant olarak Escherichia coli ekspresyon sistemlerinde çözünür olarak üretiminin yapılması amaçlanmıştır. E. coli ekspresyon sistemlerinde rekombinant protein üretiminde karşılaşılan bir problem proteinlerin çözünür olarak üretilmesidir. Bu çalışmada, SARS-CoV-2 S1 proteininin çözünür olarak üretilebilmesi amacıyla SUMO füzyon etiketi ve DsbC sinyal peptidi kullanılmıştır. SUMO füzyon etiketinin, rekombinant çözünür protein üretimine etkisinin bakılması için ilk olarak S1 geni pET SUMO vektörüne klonlanmıştır. Sekanslama ile S1 genini doğru oryantasyonda içeren plazmitler seçilmiş ve ekspresyon kontrolü için Escherichia coli SHuffle, BL21 (DE3) ve BL21 Star(DE3) pLysS suşlarına transforme edilmiştir. Sıcaklık, IPTG konsantrasyonu ve zamanın, S1 proteininin ekspresyonu üzerine etkilerine bakılmıştır. Yapılan deneyler sonucunda E.coli SHuffle hücrelerinde, 0.4 mM IPTG indüksiyonundan sonra 16 ? sıcaklıkta, 140 rpm çalkalama ile 24 saatlik inkübasyonla S1 proteininin kısmi olarak çözünür halde üretildiği belirlenmiştir. DsbC sinyal peptidinin, rekombinant çözünür protein üretiminin etkisine bakılması için pET30a (+) vektörüne klonlanmış olan S1 geninin, E.coli SHuffle hücrelerinde ekspresyon kontrolü yapılmıştır. Farklı sıcaklık, IPTG konsantrasyonu ve zaman denemelerinin sonunda pET30a (+) vektörüne klonlanmış S1 geninin SHuffle hücrelerinde çözünür olarak üretilmediği tespit edilmiştir.SARS-CoV-2 is the newest member of the Coronaviridae family that causes the Covid-19 disease, which has become a pandemic. Although Covid-19 causes deaths worldwide, it has been determined that it has left permanent damage over the years in people who have had this disease. These reasons show the importance of both Covid-19 treatment and vaccine studies. Within the scope of this thesis, it is aimed to produce recombinantly soluble S1 protein, which is the subunit of SARS-CoV-2 Spike protein, in Escherichia coli expression systems to be used in the aforementioned studies. A problem encountered in the production of recombinant proteins in E. coli expression systems is the production of proteins in soluble form. In this study, SUMO fusion tag and DsbC signal peptide were used to produce the SARS-CoV-2 S1 protein in a soluble form. To examine the effect of the SUMO fusion tag on the production of recombinant soluble protein, the S1 gene was first cloned into the pET SUMO vector. Plasmids containing the S1 gene in the correct orientation were selected by sequencing and transformed into Escherichia coli SHuffle, BL21 (DE3) and BL21 Star (DE3) pLysS strains for expression control. The effects of temperature, IPTG concentration and time on the expression of S1 protein were examined. As a result of the experiments, it was determined that S1 protein was produced in a partially soluble form in E.coli SHuffle cells after induction of 0.4 mM IPTG after 24 hours of incubation at 16 ? with 140 rpm shaking. In order to examine the effect of DsbC signal peptide on soluble protein production, S1 gene cloned into pET30a (+) vector and expression was performed in E.coli SHuffle cells. At the end of different temperatures, IPTG concentrations and time intervals, it was observed that the S1 gene cloned in the pET30a (+) vector was not expressed soluble in SHuffle cells.