Rekombinant aspergıllus nıger ksilanaz üretiminin yüksek ekspresyon için optimizasyonu ve kısmen saflaştırılmış enzimin nitelendirilmesi

Abstract

Ksilanaz enzimi farklı sektörlerdeki kullanımının yanısıra ekmekçilik sektöründe de kullanılmaktadır. A. niger kendine has özellikleri ile diğer ksilanaz üreten mikroorganizmalardan daha yüksek düzeyde ksilanaz üretebilmektedir. Bu tez çalışmasında ksilanazB geninin homolog anlatımının yapıldığı rekombinant suşlar incelenmiş ve seçilmiş transformantlarda ksilanaz üretimi erlenlerde optimize edilmiştir. Çalışma kapsamında A. niger transformantlarından diğerlerine göre daha yüksek aktivite vermiş ksilanazB transformantları 5-1-5 ve 12-1-7 kullanılmış, transformantların sahip olduğu glaA promotorunun farklı şekerlerle indüklenmesi sonucu oluşan ksilanaz üretimi incelenmiştir. Rekombinant suşta glaA promotorunun indüklenmesinde optimum maltoz yüzdesi %0,4 olarak ortaya konmuştur. Optimum üretim ortamı olarak malt çimli besiortamı belirlenmiştir. Seçilen 12-1-7 transformantı malt çimli ortamda, diğer seçilen 5-1-5 transformantından daha etkili olmuştur. Fermantasyon kültürünün etkileri karşılaştırıldığında ise, ham süpernatantlarda elde edilen ksilanaz aktivitesi malt çimli statik erlen kültüründe 39 U/ml iken aynı ortamın katı kültüründe 81 U/ml olmuştur. Erlende yapılan üretimde rekombinant enzimin optimum aktivite gösterdiği sıcaklığın 50 oC, optimum pH değerinin ise 6 olduğu saptanmıştır. Ham enzimin kısmen saflaştırılması sonrasında iki farklı büyüklükte protein elde edilmiş, bunlar kısaca rE1 ve rE2 olarak adlandırılmıştır. 33,1 kDa büyüklükteki rE1’in 355,6 U/miligram ve 21,6 kDa büyüklükteki rE2’nin 472,6 U/miligram spesifik aktiviteye sahip olduğu belirlenmiştir. Karakterizasyon adımlarında rE1 ve rE2’nin optimum sıcaklıklarının yakın ancak diğer özelliklerinin farklı olduğu görülmüştür.The xylanase enzyme is used in the bakery sector as well as in other sectors. Recombinant strains where homologous expression of xylanaseB gene were examined and xylanase production in selected transformants were optimized in flasks. In this study, xylanase B transformants 5-1-5 and 12-1-7 which gave higher activity than A. niger transformants were used and xylanase production caused by the induction of glaA promoter with different sugars was examined. The optimum maltose percentage in inducing glaA promoter in the recombinant strain was 0.4 %. The malt grass medium was determined as the optimum production environment. The selected 12-1-7 transformant was more effective in malt grass than the other selected 5-1-5 transformant. When the effects of the fermentation culture were compared, the xylanase activity obtained in the crude supernatants was 39 U/ml in the malt grassed static flask culture and 81 U/ml in the solid culture of the same medium. It was determined that the temperature at which the recombinant enzyme showed optimum activity was 50 °C and the optimum pH value was 6 in the production made in the flask. After partial purification of the crude enzyme, two different sized proteins were obtained, which are briefly referred to as rE1 and rE2. rE1 of 33.1 kDa has a specific activity of 355.6 U/milligram and rE2 of 21.6 kDa has a specific act ivity of 472.6 U/milligram. In the characterization steps, it was observed that the optimum temperatures of rE1 and rE2 were close but the other properties were different.