Streptomyces rekombinant suşlarıyla büyük ölçekli antibiyotik üretimi, ürünün izolasyonu ve kumaş boyası olrak kullanım potansiyellerinin değerlendirilmesi

Abstract

ÖZET

Streptomycetes cinsi bakteriler, yüksek antibiyotik üretim kapasiteleri ve sekonder metabolit üretme potansiyelleri nedeniyle biyoteknolojik açıdan önem taşımaktadır. Bu mikroorganizmalar, bilinen antibiyotiklerin yaklaşık %75’ini sentezleyebilmekte ve antifungal, antikanser ile immünosüpresif ajanların üretiminde rol oynamaktadır. Model organizma Streptomyces coelicolor A3(2), en az beş farklı antibiyotik üretme kapasitesine sahip olmasıyla dikkat çekmektedir. ATP’ye bağımlı Lon proteaz, bakteriler ve ökaryotlar da dahil olmak üzere çok çeşitli organizmalarda protein kalitesinin korunmasında merkezi bir rol üstlenmektedir. Yanlış katlanmış veya hasar görmüş proteinlerin yıkımını sağlayan bu enzim, hücre döngüsü, sporulasyon, metabolik düzenleme, patojenite ve stres tepkileri gibi yaşamsal süreçlere de katılmaktadır. Önceki çalışmalar, S. coelicolor’da Lon proteazın sekonder metabolit üretimi üzerinde belirgin etkiler oluşturduğunu göstermiştir. Bu tez çalışmasında, laboratuvar stoklarımızda bulunan yüksek antibiyotik üreticisi iki rekombinant suş olan Sco-pRAlon (genomunda fazladan 2 kopya lon geni taşıyan suş) ve Sco-pSPGlon (lon genini çok kopyalı bir plazmidde ifade eden suş) suşlarının antibiyotik üretimlerinin optimizasyonu ve renkli antibiyotiğin kültür ortamından izolasyonunun ardından kumaş boyası olarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır. Kültür koşullarının optimizasyonu sonucunda 96. saatte Sco-pRAlon suşu yaban suşa göre yaklaşık 18–19 kat, Sco-pSPGlon suşu ise yaklaşık 9 kat daha yüksek seviyede antibiyotik üretmiştir. Renkli antibiyotik olan aktinorhodin üretimi için en verimli suşun Sco-pRAlon olduğu belirlendiğinden çalışmaya bu suş ile devam edilmiş ve kültür hacmi, inokulum miktarı ile çalkalama hızının antibiyotik üretimi üzerine etkileri belirlenmiştir. Artan kültür hacminin ve inokulum büyüklüğünün antibiyotik üretimini negatif yönde etkilediği bulunmuştur. Bu optimizasyon çalışmaları sonucunda elde edilen veriler ile Sco-pRAlon suşunun aktinorhodin üretimi büyük ölçekli fermentörde 1,5 litre hacminde gerçekleştirilmiştir. Fermentör şartlarında erlenmeyer koşullarından daha düşük bir verim elde edilmiş, büyük hacim çalışmalarında bütün parametrelerin fermentörde tekrar optimize edilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır. Bu süreçte üretilen aktinorhodin kültür ortamından izole edilmiş ve pigmentin tekstil alanındaki kullanım potansiyeli değerlendirilmiştir. Doğal pigmentle boyanmış kumaş parçalarındaki boyanın sabitlenmesi için farklı yöntemler kullanılmıştır. Isı, NaCl ve asetik asit çözeltileri tek tek ve farklı kombinasyonlar halinde uygulanmış ve en uygun boya sabitleme işleminin asetik asit ile sağlandığı görülmüştür. Elde edilen bulgular, Lon proteazın Streptomyces’lerde antibiyotik üretimini teşvik ettiğini teyit ederken, renkli bir antibiyotik olan aktinorhodinin biyoteknolojik üretimi ve sürdürülebilir boya teknolojilerindeki potansiyel kullanımına dair değerli veriler sunmaktadır. Anahtar Kelimeler: S. coelicolor, Lon proteaz, Aktinorhodin vi

ABSTRACT

Bacteria of the genus Streptomycetes are of great biotechnological importance due to their high antibiotic production capacity and potential for secondary metabolite synthesis. These microorganisms are capable of synthesizing approximately 75% of known antibiotics and play a role in the production of antifungal, anticancer, and immunosuppressive agents. The model organism Streptomyces coelicolor A3(2) stands out for its ability to produce at least five different antibiotics. The ATP-dependent Lon protease plays a central role in maintaining protein quality across a wide range of organisms, including both bacteria and eukaryotes. This enzyme, responsible for the degradation of misfolded or damaged proteins, is also involved in essential cellular processes such as cell cycle regulation, sporulation, metabolic control, pathogenicity, and stress responses. Previous studies have demonstrated that the Lon protease exerts significant effects on secondary metabolite production in S. coelicolor. The objective of this thesis study is twofold: first, to optimize the antibiotic production of two recombinant strains, Sco-pRAlon (a strain carrying two additional copies of the lon gene in its genome) and Sco-pSPGlon (a strain expressing the lon gene from a multicopy plasmid), which are high antibiotic producers found in our laboratory stocks; and second, to evaluate them as fabric dyes following the isolation of colored antibiotics from the culture medium. As a result of culture optimization, the Sco-pRAlon strain produced approximately 18–19 times higher levels of antibiotic than the wild-type strain at 96 hours, while the Sco-pSPGlon strain showed approximately 9-fold higher production. Since the most efficient strain for the production of the colored antibiotic actinorhodin was determined to be Sco-pRAlon, the study continued with this strain, and the effects of culture volume, inoculum size, and agitation speed on antibiotic production were determined. It was found that increasing the culture volume and inoculum size negatively affected antibiotic yield. Based on the optimization data obtained, actinorhodin production by the Sco-pRAlon strain was carried out in a large-scale fermenter with a working volume of 1.5 liters. Under fermenter conditions, the yield was lower than that obtained in Erlenmeyer flasks, leading to the conclusion that all parameters must be re-optimized for larger-scale production. Actinorhodin produced during this process was isolated from the culture medium, and the pigment's potential for use in the textile industry was evaluated. To ensure color fixation on fabric samples dyed with the natural pigment, different fixation methods were tested. Heat, NaCl, and acetic acid solutions were applied individually and in various combinations, revealing that the most effective dye fixation was achieved using acetic acid. The findings of this study confirm that the Lon protease promotes antibiotic production in Streptomyces species and provide valuable insights into the biotechnological production of the colored antibiotic actinorhodin, as well as its potential use in sustainable dye technologies. Keywords: S. coelicolor, Lon protease, Actinorhodin