Screeining of a synthetic human SCFV library against vascular endothelial growth factor receptor-2 (vegfr 2) for identification of potential therapeutic candidates

Abstract

ABSTRACT

Angiogenesis, the development of new blood vessels from pre-existing ones, is an essential process in both physiological and pathological conditions. In cancer, tumor cells promote angiogenesis to ensure the delivery of oxygen and nutrients required for their growth and survival. Vascular endothelial growth factor (VEGF) and its receptors (VEGFRs), particularly VEGFR-2, are central regulators of tumor angiogenesis and represent important therapeutic targets. Although several anti-VEGF/VEGFR therapeutics, such as monoclonal antibodies and small-molecule inhibitors, have been clinically approved, their overall efficacy remains limited. With the growing interest in anti-angiogenic therapy and its combination with immunotherapy in cancer treatment, there is still a need for improved anti-VEGF/VEGFR drugs. In this study, VEGFR-2, the principal signaling receptor of the VEGF family, was targeted for the development of single-chain variable fragment (scFv) antibodies capable of inhibiting VEGF-VEGFR-2 interaction. For that purpose, a novel synthetic human scFv library was screened against VEGFR-2 using phage display technology. Four cycles of selection and enrichment, known as biopanning, were carried out using solution-based incubation of phage-scFv clones with VEGFR-2. Following the final round, 60 randomly selected clones were screened by phage ELISA to identify high-affinity binders to VEGFR-2. The selected scFv binders were then subjected to Sanger sequencing, and unique scFv antibodies with diverse CDR profiles were identified. These unique scFv antibodies were later successfully expressed in soluble form in Escherichia coli expression system and purified using protein L affinity chromatography. Binding specificity and affinity of soluble scFv antibodies to VEGFR-2 were confirmed via ELISA. Functional evaluation of their anti-angiogenic potential was performed using in vitro endothelial cell viability and wound healing assays. While the scFv antibodies showed limited inhibition of VEGF-driven cell survival and proliferation, one scFv notably suppressed endothelial cell migration. Further optimization of expression and stability profiles may enhance their anti-angiogenic effects. In conclusion, this study successfully identified and characterized novel anti-VEGFR-2 scFv antibody fragments derived from a synthetic human scFv antibody library. Keywords: Anti-VEGF/VEGFR Antibodies, scFv Antibody, Synthetic Human scFv Library, Cancer Therapy, Phage Display vii

ÖZET

Anjiyogenez, mevcut damar yapılarından yeni kan damarlarının oluşumu, hem fizyolojik hem de patolojik koşullarda önemli bir süreçtir. Kanserde, tümör hücreleri büyümek ve hayatta kalmak için gerekli oksijen ve besin maddelerinin taşınmasını sağlamak amacıyla anjiyogenezi teşvik eder. Vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF) ve reseptörleri (VEGFR'leri), özellikle VEGFR-2, tümör anjiyogenezinin temel düzenleyicileridir ve bu nedenle önemli terapötik hedefler olarak kabul edilmektedirler. Monoklonal antikorlar ve küçük moleküllü inhibitörler gibi çeşitli anti-VEGF/VEGFR ilaçları klinik olarak onaylanmış olsa da, bu ajanların genel etkinliği sınırlı kalmaktadır. Anjiyogenez karşıtı tedavilere ve bu tedavilerin immünoterapi ile kombinasyonlarına artan ilgi, daha etkili anti-VEGF/VEGFR ilaçlarına olan ihtiyacı sürdürmektedir. Bu çalışmada, VEGF ailesinin temel sinyal iletim reseptörü olan VEGFR-2, VEGF-VEGFR-2 etkileşimini engelleyebilecek tek zincirli değişken fragment (scFv) antikorlarının geliştirilmesi amacıyla hedeflenmiştir. Bu amaç doğrultusunda, sentetik olarak tasarlanmış yeni bir insan scFv kütüphanesi, faj gösterim teknolojisi kullanılarak VEGFR-2'ye karşı taranmıştır. Biopanning olarak bilinen seçilim ve zenginleştirme işlemi, dört döngü boyunca phage-scFv klonlarının VEGFR-2 ile çözeltide inkübasyonu yoluyla gerçekleştirilmiştir. Son döngünün ardından, rastgele seçilen 60 klon faj ELISA ile taranmış ve yüksek afiniteye sahip bağlayıcılar belirlenmiştir. Seçilen scFv bağlayıcılar daha sonra Sanger sekanslama yöntemiyle dizilenmiş ve çeşitli CDR profillerine sahip özgün scFv antikorları tanımlanmıştır. Bu özgün scFv antikorları, Escherichia coli ekspresyon sistemi kullanılarak çözünür formda başarıyla üretilmiş ve protein L afinite kromatografisi ile saflaştırılmıştır. Çözünür scFv antikorlarının bağlanma özgüllüğü ve afinitesi ELISA ile doğrulanmıştır. Bu antikorların anti-anjiyojenik potansiyeli, in vitro endotelyal hücre canlılığı ve yara iyileşmesi deneyleri ile fonksiyonel olarak değerlendirilmiştir. ScFv antikorları VEGF ile uyarılan hücre canlılığı ve proliferasyonunu sınırlı düzeyde inhibe etmiş olsa da, bunlardan birinin endotelyal hücre göçünü anlamlı biçimde baskıladığı gözlemlenmiştir. Ekspresyon düzeyi ve stabilite profillerinin daha da optimize edilmesi, bu antikorların anti-anjiyojenik etkilerini artırabilir. Sonuç olarak, bu çalışma, sentetik insan scFv antikor kütüphanesinden türetilmiş yeni anti-VEGFR-2 scFv antikor fragmanlarını başarıyla tanımlamış ve karakterize etmiştir. Anahtar Kelimeler: Anti-VEGF/VEGFR Antikorları, scFv Antikoru, İnsan Sentetik scFv Antikor Kütüphanesi, Kanser Terapisi, Faj Gösterimi