Streptococcus pneumoniae bakterisine özgü aptamer seçimi

Abstract

Sentetik olarak elde edilen ve belirli hedeflere özgü olan tek zincirli DNA ya da RNA yapısındaki kısa oligonükleotidlere "aptamer" denir. Aptamerlerin kullanım alanları çeşitli olsa da genellikle tanı ve tedavi amacıyla kullanılırlar. Bu çalışmada zatürre hastalığına yol açan Streptococcus pneumoniae bakterisine spesifik bağlanan ve hızlı bir şekilde bu bakterinin tanısında kullanılabilecek DNA aptamerlerinin seçilmesi amaçlandı. Bu doğrultuda, DNA aptamer kütüphanesi tasarlanıp yapay olarak sentezlendi ve aptamer seçim işlemi "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment" (SELEX) yöntemiyle gerçekleştirildi. Aynı cins Streptococcus sanguinis bakterisi, karşıt hedef olarak kullanılarak elde edilecek aptamerlerin daha özgün olması amaçlandı. Bu doğrultuda, oligonükleotid kütüphanesi ilk olarak S. sanguinis bakterisiyle inkübe edildi (karşıt-SELEX) ve bu bakteriye bağlanmayan, geri kalan oligonükleotidler ayrıştırılarak S. pneumoniae bakterisiyle inkübe edildi (SELEX). Toplamda, bu işlemler 4 karşıt-SELEX ve 4 SELEX döngüsü olacak şekilde tekrarlandı. SELEX işleminin sonunda 4 adet aptamer elde edildi ve DNA dizinleri belirlendi. Akış sitometri (flow cytometry) tekniği kullanılarak FAM işaretli aptamerlerle yapılan bağlanma çalışmaları sonucu 4 aptamer içinde sadece bir aptemerin (B40) bakteriye zayıf bağlandığı bulunmuştur. Veriler Hill denkleminde fit edilerek aptamer B40 için yarı doygunluk değeri (K) 1375 ± 151 nM, Hill katsayısı (n) 1.55 ± 0.20 olarak bulunmuştur. Çok spesifik sonuç vermesi beklenen SELEX işleminden beklenilen sonucun elde edilememesinin olası nedenleri tartışılmıştır.Aptamers are synthetic, single-stranded, short DNA or RNA oligonucleotides that bind with high affinity to a targeted-molecule. Despite the wide range of use, aptamers were generally applied for diagnostic and treatment purposes. The objective of this study was to find aptamers that selectively bind S. pneumoniae bacteria that cause pneumonia in humans. For this purpose, 75 base DNA aptamer library was synthesized. Using this library, the selection of aptamers was done by the method called "Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment" (SELEX). In the SELEX method, S. sanguinis was used as a counter target to increase aptamer specificity for S. pneumoniae. For this purpose, aptamer library was first incubated with S. sanguinis (counter-SELEX). The nonbinding aptamers were separated and incubated with S. pneumoniae (SELEX). In total 4 counter-SELEX and 4 SELEX cycles were carried out. 4 aptamers were obtained and their DNA sequences were determined. Binding of aptamers to S. pneumoniae was analyzed by Flow cytometry. Among four aptamers only one (B40) was found to bind weakly to the bacteria. The data was fit to the Hill equation and gave half-saturation value (K) of 1373 ±151 nM and Hill coefficient (n) of 1.55 ± 0.20. Overall, these results show that the aptamers obtained by SELEX method are not selective to S. pneumoniae, indicating that getting false positive results by the SELEX method is likely.