Plazma/serumda toplam homosistein miktarının ESI-LC-MS/MS yöntemiyle ölçülmesi

Abstract

Bu tez çalışmasında, sıvı kromatografisi/elektrosprey iyonizasyonlu ardışık kütle spektrometresi (ESI-LC-MS/MS) yöntemi kullanılarak tHcys'nin kantitatif ölçümü için türevlendirme esaslı bir yöntem geliştirilmiştir. Bu yöntemde örnekler propil kloroformat ile reaksiyona sokularak Hcys-propil esteri elde edilmiş olup, internal standart olarak kullanılan homosistein-d4 varlığında analiz edilmiştir. Örnekler, aynı zamanda, türevlendirme işlemi yapılmadan da ESI-LC-MS/MS yöntemi ile analiz edilmiştir. Her iki yöntemle elde edilen sonuçlar doğrusallık, tekrarlanabilirlik, örnek kararlılığı ve teşhis ve miktarlandırma limitleri açısından karşılaştırılmıştır.Lineerite çalışmasında türevsiz yöntem için lineerite aralığı 0-35 µmol/L, türevli yöntem içinse 0-50 µmol/L olarak bulunmuştur Tekrarlanabilirlik çalışmasında ise relatif standart sapma değerleri (%RSD) %4,48-7,62 arasında değişirken, türevli yöntem için %1,77-2,06 arasında değişmektedir. Teşhis limitleri türevsiz ve türevli yöntem için sırasıyla 0,24 µmol/L ve 0,07 µmol/L olarak hesaplanmıştır. Miktarlandırma limitleri de türevsiz ve türevli yöntem için sırasıyla 0,80 µmol/L ve 0,23 µmol/L olarak hesaplanmıştır. Stabilite çalışmasında türevli örneklerin türevsiz örneklere göre daha kararlı olduğu gözlemlenmiştir.Sonuç olarak türevli yöntemde örnek hazırlama aşamaları ve süresinde bir miktar artış olmasına rağmen yöntemin doğrusallığı, tekrarlanabilirliği, teşhis ve miktarlandırma limitleri ve örnek stabilitesi gibi konularda belirgin avantajlar sağlanmıştır.In this study, a derivatization based liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry (ESI-LC-MS/MS) method for the quantitative determination of total homocysteine in plasma/serum has been developed. The propyl ester of homosistein formed upon the treatment of the samples with propyl chloroformate. The derivatized samples were analyzed under the presence of the deuterated internal standards homocysteine-d4. The underivatizated samples were also analyzed by ESI-LC-MS/MS method. Both underivatized and derivatized methods were compared in terms of linearity, repeatibility, stability of samples and limit of detection and quantitation.The linearity ranges were 0-35 µmol/L and 0-50 µmol/L for underivatized and derivatized homocsyteine, respectively. The relative standart deviations ranged from 4,48 to 7,62% for underivatized homocysteine and from 1,77 to 2,06% for derivatized methods. The limits of detection were 0,24 µmol/L and 0,07 µmol/L for underivatized and derivatized methods, respectively. The limits of quantitation were 0,80 µmol/L for underivatized method and 0,23 µmol/L for derivatized method. Derivatized samples were found to be more stable than underivatized ones.Overall, in spite of some extra steps and extra time for sample preparation, the derivatizated method gave better results compared to the underivatized one in terms of linearity, repeatibility, stability of samples and limit of detection and quantitation.