Hyoscyamus niger kök kültüründe sekonder metabolit üretimi

Abstract

Bu çalışmanın temel amacı, Hyoscyamus niger (banotu) bitkisinin bitki doku kültürü yöntemleri kullanılarak in vitro koşullarda kök ve sekonder metabolit üretiminin artırılmasını sağlamaktır. H. niger içeriğinde bulunan tropan alkaloidleri nedeniyle tıbbi açıdan öneme sahiptir. Çalışmada, MS (Murashige and Skoog) ve yarım MS besin ortamında pH'nın 5,8 ile 6,5 olduğu, IBA (İndol bütirik asit) içeren ve içermeyen şartlarda kök kültürleri yapıldı. 21 günlük çalışma sonrası köklerin yaş ve kuru ağırlıkları alınıp büyüme yüzdeleri hesaplandı. Elde edilen köklerden alkaloid ekstraksiyonu yapıldı. İnce tabaka kromatografisi ve HPLC yöntemi ile tropan alkaloidler analiz edildi. Ayrıca, çalışma kapsamında tohum sterilizasyonu ve saflaştırma yöntemlerinin de optimizasyon çalışmaları yapıldı. Köklerin yaş ağırlık ortalaması alındığında ½ MS+0,1 IBA, pH:5,8 ortamında ortalama 1,923 gram ile diğer gruplara göre en yüksek yaş ağırlık miktarı gözlendi. MS+0,1 IBA, pH:5,8 ortamında ise 1,860 gram ile ikinci en yüksek ağırlık gözlendi. Kuru ağırlıklarda en yüksek değerler MS+0,1 IBA, pH:5,8 ortamında gelişen köklerde ortalama 0,190 gram, MS+0,1 IBA, pH:6,5 ortamında gelişen köklerde 0,183 gram olarak gözlendi. Bu durum, ½ MS ortamında gelişen köklerin MS ortamında gelişenlere oranla daha fazla su içerdiğini gösterdi. 2. protokol ile yapılan alkaloid saflaştırma sonuçlarına göre IBA içermeyen ortamlarda gelişen H. niger köklerinden elde edilen ekstrelerin, IBA içeren ortamlarda gelişen köklere oranla daha saf olduğu sonucuna varıldı. HPLC analizi sonuçları her iki ekstraksiyon protokolü ile yapılan aynı örneklerde ekstre miktarı gibi atropin miktarının da 2. protokolde daha fazla olduğunu gösterdi. Sonuç olarak, kök oluşumu ve kütle artışı IBA içeren gruplarda içermeyenlerden yüksek olmasına karşın, alkaloid miktarları IBA'sız ortamda gelişen köklerde daha fazla tespit edildi.The main aim of this study is to increase the root and secondary metabolite production of Hyoscyamus niger (henbane) plant in vitro using plant tissue culture methods. H. niger is medically important due to its tropane alkaloids. In this study, root cultures were made under conditions with and without IBA (Indol butiric acid), pH between 5.8 and 6.5 in MS0 and half MS medium. After 21 days of study, wet and dry weights of the roots were taken and growth index were calculated. Alkaloid extraction was performed from the obtained roots. The tropane alkaloids were analyzed by thin layer chromatography and HPLC. In addition, optimization of seed sterilization and purification methods were performed. When the average wet weight of the roots was measured, half MS + 0.1 IBA, pH: 5.8 medium, and the highest wet weight were obtained with an average of 1.923 grams. The second highest weight was observed with MS + 0.1 IBA and pH: 5.8 medium with 1,860 grams. The highest values in dry weights were observed as average of 0.190 grams in roots developing in MS + 0.1 IBA pH: 5.8 and 0.183 grams in roots developing in MS + 0.1 IBA pH: 6.5. According to the results of alkaloid purification with 2. protocol, it was concluded that extracts obtained from H.niger roots developed in without IBA media were more pure than roots developed in with IBA media. Two extraction protocols were applied to the same sample and HPLC analysis was performed. As a result, the amount of atropine was higher in 2 protocol. As a result, root formation and mass increase were higher in the roots growing in nutrient medium with IBA than in nutrient medium without IBA and alkaloid levels were higher in the roots developing in nutrient medium without IBA.