Development of a novel L-asparaginase enzyme for acute lymphoblastic leukemia therapy

Abstract

L-asparajinazlar (L-ASNaz'lar, EC 3.5.1.1), L-asparajini (L-Asn) L-aspartik asit (L-Asp) ve amonyağa dönüştüren amidohidrolaz enzimleridir. Bazı L-ASNaz'lar ayrıca L-glutamini (L-Gln) L-glutamik aside (L-Glu) dönüştürmeyi katalizleyebilir. Escherichia coli ve Erwinia chrysanthemi kaynaklı L-ASNaz'lar akut lenfoblastik lösemi (ALL) tedavisinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, bu bakteriyel enzimler sıklıkla L-glutaminaz (L-GLNaz) aktiviteleri nedeniyle zararlı yan etkilere ve aşırı duyarlılık reaksiyonlarına yol açar. Bu nedenle, bu tez, alternatif kaynaklardan düşük L-GLNaz aktivitesine sahip, daha az yan etkiye sahip olabilecek yeni L-ASNaz'ların tanımlanmasını amaçlamaktadır. Bu tezde, tip I ve II sınıflarına ait 10 yeni bakteriyel ve maya L-ASNaz'nın detaylı biyokimyasal karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. En yüksek katalitik verimliliğe sahip L-ASNaz için yapısal modelleme ve protein mühendisliği çalışmaları yapılmıştır. Elde edilen mutant L-ASNaz'ların ALL hücre hatları üzerindeki sitotoksik ve apoptotik etkileri incelenmiş ve ticari L-ASNaz ile karşılaştırılmıştır. Tanımlanan L-ASNaz'lar için optimum pH ve sıcaklık sırasıyla pH 7.0 ila 9.0 ve 35°C ila 50°C aralığında bulunmuştur. Elde edilen L-ASNaz'ların hiçbiri ölçülebilir L-GLNaz aktivitesi göstermemiştir. L-ASNaz'ların yapısal karşılaştırmaları, katalizde rol oynayan kalıntıların korunduğunu ve substrata yakın pozisyon 59'daki farklılıkların kinetik parametreleri etkileyebileceğini ortaya koymuştur. Bu tezde incelenen L-ASNaz'lar arasında, maya Lachancea thermotolerans (LtASNaz) kaynaklı tip I L-ASNaz, L-Asn için en yüksek spesifik aktiviteyi (313.82 U/mg) ve katalitik verimliliği göstermiştir, bu da onu ileri araştırmalar için umut verici bir aday yapmıştır. LtASNaz'ın Lys99 (E. coli'de 59) pozisyonunu hedef alan mutasyon çalışmaları, enzim aktivitesini önemli ölçüde artırmıştır. Lys99Ala mutasyonu, LtASNaz'ın aktivitesini yaklaşık 3,2 kat, katalitik verimliliğini ise 2 kat artırmıştır. Yabanıl tip ve mutant LtASNaz'ların SUP-B15 hücreleri ve tedaviye dirençli REH ALL hücreleri üzerindeki sitotoksik ve apoptotik etkileri değerlendirilmiş; Lys99Ala LtASNaz, SUP-B15 hücre proliferasyonunda ticari L-ASNaz'a benzer düzeyde önemli bir azalma ve REH hücrelerinde kısmi bir azalma göstermiştir. Sonuç olarak, bu tez, L-GLNaz aktivitesi göstermeyen yeni L-ASNazların tanımlanmasıyla L-ASNaz literatürüne önemli bir katkı sağlamaktadır. Maya kaynaklı Lys99Ala LtASNaz mutantı, ticari L-ASNaz ile benzer apoptotik etkiler göstermektedir. Bu enzimin tanımlanması ve yapısal modelleme çalışmaları, ökaryotik kaynaklardan yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmek için önemli bir temel sunmaktadır. Elde edilen mutant enzimin yüksek aktivitesi ve pratik performansı, gelecekteki akrilamid parçalama gibi çeşitli uygulamalar için potansiyelini ortaya koymaktadır. Ayrıca, bu enzimin etkinliği, ticari üretim için ölçek büyütme çalışmalarında güçlü bir aday olduğunu göstermektedir.L-asparaginases (L-ASNases, EC 3.5.1.1) are amidohydrolase enzymes that convert L-asparagine (L-Asn) into L-aspartic acid (L-Asp) and ammonia. Some L-ASNases can also catalyze the conversion of L-glutamine (L-Gln) into L-glutamic acid (L-Glu). L-ASNases derived from Escherichia coli and Erwinia chrysanthemi are widely utilized in the treatment of acute lymphoblastic leukemia (ALL). However, these bacterial enzymes frequently induce harmful side effects and hypersensitivity reactions, primarily due to their L-glutaminase (L-GLNase) activity. Therefore, this thesis aims to identify novel L-ASNases from alternative sources with low L-GLNase activity that may have fewer side effects. This thesis presents a detailed biochemical characterization of 10 novel bacterial and yeast L-ASNases from classes I and II. Structural modeling and protein engineering studies were performed for the L-ASNase which exhibited the highest catalytic efficiency. The cytotoxic and apoptotic effects of the obtained mutant L-ASNases on ALL cell lines were examined and compared with commercial L-ASNases. The optimal pH and temperature for the identified L-ASNases were found to be in the range of pH 7.0 to 9.0 and 35°C to 50°C, respectively. None of the obtained L-ASNases exhibited measurable L-GLNase activity. Structural comparisons of the L-ASNases revealed that the residues involved in catalysis were conserved and that variations at position 59 near the substrate-binding site might affect kinetic parameters. Among the L-ASNases studied in this thesis, the type I L-ASNase from the yeast Lachancea thermotolerans (LtASNase) demonstrated the highest specific activity (313.82 U/mg) and catalytic efficiency for L-Asn, making it a promising candidate for further research. Mutation studies targeting the Lys99 position (equivalent to position 59 in E. coli) of LtASNase significantly enhanced enzyme activity. The Lys99Ala mutation increased LtASNase activity by 3.2-fold and catalytic efficiency by 2-fold. The cytotoxic and apoptotic effects of wild-type and mutant LtASNases on SUP-B15 cells and treatment-resistant REH ALL cells were evaluated; Lys99Ala LtASNase demonstrated a significant reduction in SUP-B15 cell proliferation similar to commercial L-ASNase and a partial reduction in REH cells. In conclusion, this thesis provides a substantial contribution to the L-ASNase literature by identifying novel L-ASNases with no L-GLNase activity. The identification of yeast-derived Lys99Ala LtASNase mutant, which shows comparable apoptotic effects to commercial L-ASNase, provides a valuable basis for developing new therapeutic approaches from eukaryotic sources. The structural modeling studies conducted further support this development. The high activity and practical performance of the obtained mutant enzyme reveal its potential for various future applications, such as acrylamide degradation. Additionally, its effectiveness indicates that it is a strong candidate for scale-up studies for commercial production.