Role of RTCB protein under stress conditions

Abstract

RTCB (RNA 2',3'-siklik fosfataz ve 5'-OH ligaz) enzimleri 2'-3' siklik fosfat veya 3'fosfat ucunu 5'hidroksil ucuna ekleyen atipik RNA Ligaz ailesidir ve trna ve mrna ekzonlarının kırpılması gibi hücresel süreçlerde rol alır. RTCB ayrıca, katlanmamış protein cevabı sürecinin alt basamağında yer alan, Xbp1 Mrna'sının kırpılmasinda görev alır. Sirkadiyen saat, kendi kendini kontrol eden, çevresel faktörlere uyum sağlamayı kolaylaştıran biyokimyasal bir döngüdür. Memelilerde sirkadiyen ritim iki temel parçadan oluşur: merkezi saat ve çevresel saat. Moleküler düzeyde sirkadiyen saat sistemi 4 sirkadiyen geninin işlevine bağlıdır: Block, BMal1, Cryptochrome 1 ve Cryptochrome 2. Bu genler transkripsiyon-translasyon döngüsü oluşturur. Sirkadiyen ritim iç ve dış kaynaklı apoptoz da dahil olmak üzere hemen her hücresel süreci doğrudan veya dolaylı olarak etkiler. Sirkadiyen ritim hücresel stres cevaplarını kontrol ettiği için ve RTCB'nin er stres cevabındaki rolü ve RNA yapıştırmasındaki rolü sebebiyle RTCB ligaz proteininin seviyesinin er stres, oksidatif stres ve DNA hasarı gibi hücresel stres sonucu oluşan apoptoz sürecinde değişebileceğini öngördük. Bu sorunu aydınlatmak için oksaliplatin ve cisplatin DNA hasarı, tunikamisin ER stres ve t tert-Bütil hidroperoksit oksidatif stres oluşturmak için kullanıldı. RTCB seviyesi immunoblot ile ölçüldü. C-PARP seviyesi apoptoz belirteci olarak kullanıldı. Sirkadiyen ritim sistemi ve rtcb arasındaki ilişkiyi göstermek için üçlü knockout ve tekli knockout hücreler kullanildı Son olarak, RTCB yokluğunda stres cevabı değişikliklerini ölçmek için RTCB knockout hücreleri kullandık. Elde edilen sonuçlar, stresin teşvik ettiği apoptoz ve biyolojik saat sisteminin RTCB ligaz protein seviyeleri ile ilişkisinin olmadığını göstermektedir. Bununla birlikte, RTCB ligazın hücresel işlevlerinin anlaşılması için çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır.RTCB (RNA 2',3'-cyclic phosphate and 5'-OH ligase) enzymes are atypical RNA ligase family that joins 2'-3' cyclic phosphate or 3' phosphate termini to 5' hydroxyl termini and have different roles in cellular processes such as splicing tRNA and mRNA exons. RTCB also functions in unconventional splicing of Xbp1 mRNA, downstream element of Unfolded Protein Response (UPR). Circadian clock is an autonomuous biochemical oscillator system that facilitates to adapt environmental factors. Mammalian circadian clock system is consisted of two main parts: master clock and peripheral clock system. At molecular level, circadian clock system depends on the function of 4 genes: Clock, Bmal1, Cryptochrome 1 and Cryptochrome 2. These genes generate a transcription-translation feedback loop (TTFL). Circadian clock directly and indirectly influence almost all the cellular processes including extrinsic or intrinsic apoptosis. Because of circadian clock regulates the main responses to cellular stresses and RTCB plays role in ER stress response and responsible for RNA ligation, we hypothesized that RTCB ligase level may be influenced by cellular stress induced apoptosis such as ER stress, oxidative stress and DNA damage. We used oxaliplatin and cisplatin for inducing DNA damage, tunicamycin for inducing ER stress and tert-Butyl hydroperoxide (tBHP) for oxidative stress. We used immunoblotting to detect the RTCB level and c-PARP level as apoptosis marker. In order to see the correlation between circadian clock system and RTCB, we used triple knockout and single clock knockout cells. Finally, we used RTCB knockout cells to determine the stress response changes in absence of RTCB. Results indicate that neither stress induced apoptosis nor circadian clock system directly correlates with the RTCB ligase in protein level. Yet, further studies are required to understand the cellular functions of RTCB ligase.