Olası bakteriyel hücre iskelet sisteminin immün floresan boyama yöntemi ile gösterilmesi

Abstract

Hücre iskelet sistemi, ökaryot hücrelerde sitoplazmada protein filamentlerinden oluşan bir sistemdir. Bu sistem, hücrenin belirli bir şekle sahip olması, hücre bölünmesinde kromozomların birbirinden ayrılması, hücrenin ikiye bölünmesi ve içinde bir yerden başka bir yere madde taşınması gibi olaylarda rol alır. Yakın bir geçmişe kadar hücre iskelet sisteminin ökaryotik hücrelere özgü bir sistem olduğunun düşünülmesine karşın, son yirmi yılda yapılan yapısal ve biyokimyasal çalışmalar, FtsZ, MreB ve crescentin proteinlerinin sırasıyla tubulin, aktin ve ara filament proteinlerinin prokaryotik atası olduğuna dair bilgiler içermektedir.Bu tez çalışması kapsamında kullanılan bakteri örnekleri, daha önce yapılmış bir doktora çalışmasında laboratuvarımızda kullanılan Escherichia coli JM 109, E. coli K92 ATCC 35860 bakteri suşları, E. coli K92 ATCC 35860 soyunun kapsül yapısını oluşturan polisialik asitlerin yüzeye eklenmesinden sorumlu olan sialiltransferaz enziminin sentezini sağlayan neuS genini taşıyan rekombinant E. coli JM 109 pUC19-ST ve neuS geninin nokta mutasyonlarını içeren rekombinantlar E. coli JM 109 pUC19-ST M2 ve E. coli JM 109 pUC19-ST M3'tür. Bu örneklere ek olarak Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Uygulama Merkezi (EBİLTEM) tarafından hediye edilen kolleksiyon bakterileri E. coli ATCC 8739, E. coli ATCC 29998, B. subtilis ATCC 6634 ve Micrococcus luteus ATCC 9341 kullanıldı.Bu tez çalışmasında bakteriyel hücre iskelet sistemi FtsZ proteini çalışılmıştır. Buna göre, FtsZ proteinine özgül bir Western blot antikoru olan Anti-FtsZ ile işaretlenerek Alexa Fluor®488 boyası içeren FluoroNanogoldTM ile boyanmıştır. Özgün bağlanmış FtsZ proteini tüm bakteri örneklerinde floresan mikroskobu ile gösterildi. Çekilen mikrograflarda FtsZ proteini genel olarak her üç hücre morfolojisinde (kok-kokobasil, basil, kok) sitoplazmada dağılmış halde ve yer yer hücre zarına bağlı olarak bulundu. FtsZ proteini bölünme aşamasında bölünme bölgesinin tam ters yönünde hücrenin kutuplarında, zara bağlı ve/veya sitoplazmada küçük birikintiler halinde gözlendi.Çalışmanın özgünlüğünü sağlayan sonuçlar ise bölünme aşamasındaki prokaryot hücrelerde, FtsZ proteini şimdiye kadar yapılan diğer çalışmalardan farklı olarak kutuplara doğru ve zarda birikim gösterdi. İlk defa FtsZ için özgül bir Western blot antikoru, immün floresan işaretleme protokolünde kullanıldı ve bu proteine yönelik özgün sonuçlar alındı.Cytoskeleton is the special system that is made up of protein filaments in the eukaryotic cell cytoplasm. This system has roles in the events like formation of the cell shape, separation and distribution of the chromosomes during cell division, and transportation of the materials inside the cell. Until lately, it was thought that cytoskeleton is a system that is specific to eukaryotes, however the structural and biochemical studies done in the last twenty years include data on FtsZ, MreB, and crescentin proteins are prokaryotic ancestors of tubulin, actin, and intermediate filament proteins respectively.The bacteria samples employed within this thesis are used in our laboratory for a previous study such as Escherichia coli JM 109, E. coli K92 ATCC 35860, recombinant E. coli JM 109 pUC19-ST carrying neuS gene that provides the synthesis of sialyltransferase enzyme responsible for the addition of polysialic acids onto the surface which constitute capsule structure of E. coli K92 ATCC 35860 strain, and recombinants E. coli JM 109 pUC19-ST M2 and E. coli JM 109 pUC19-ST M3 including the point mutations of neuS gene. In addition to these samples, collection bacteria E. coli ATCC 8739, E. coli ATCC 29998, B. subtilis ATCC 6634 and Micrococcus luteus ATCC 9341 donated as a gift by EBİLTEM (Ege Üniversitesi Bilimsel Araştırma Uygulama Merkezi- Ege University Application Center for Scientific Research), were employed.In this thesis, bacterial cytoskeleton system, FtsZ protein, was studied. Accordingly, it was marked by Anti-FtsZ, a Western blot antibody specific to FtsZ protein, and then with FluoroNanogoldTM including Alexa Fluor®488 dye. Specifically labeled FtsZ protein was monitored by fluorescent microscope for all bacteria samples. In the micrographs taken, FtsZ protein was generally found to be spread in the cytoplasm in all three cell morphologies (coccus-coccobacillus, bacillus, coccus), and to be bound to the cell membrane in some areas. FtsZ protein was observed in the polar regions of the cell just opposite the division site in the division stage, bound to the cell membrane, and/or in small aggregations in the cytoplasm.The results that provide the uniqueness of the study showed that, unlike the studies carried out so far, in prokaryotic cells in the division stage, FtsZ protein aggregated close the poles and in the membrane. A Western blot antibody specific to FtsZ was used for the first time in the immunofluorescent procedure and unique results were obtained for this protein.