Exploring the interactome of recombinant CRY1 protein by proximity labeling

Abstract

Sirkadiyen ritimler, iç zamanı jeolojik saat ile koordine etmeye yarayan sirkadiyen saat mekanizması tarafından üretilen 24 saatlik salınımlardır. Bu ritim, fizyolojide ana bir düzenleyicidir ve bozulmasının sağlık üzerinde önemli sonuçları vardır. Dört faktörden oluşan kendi kendine devam eden bir transkripsiyonel-translasyonel geri besleme döngü mekanizması, transkriptom seviyesinde moleküler salınımlar üretir. Moleküler saatin ana temel mekanizması açıklanmış olmasına rağmen, birçok önemli husus detaylı olarak araştırılamamıştır. Çekirdek saat faktörlerinin geçici ve dinamik etkileşimleri incelenmemiştir. Sirkadiyen saat proteomun %20-40'ını düzenlediğinden, saat proteinlerinin etkileşimleri yeni ilaç adayları için yeni hedefler olacaktır. Çekirdek saat proteini olan CRY1'in zıt fazlarda sirkadiyen etkileşimini tanımlamak için yakınlığa bağlı biyotinlemeyle tanımlama (BioID) tekniğini kullandık. Bunun için, miniTurbo biyotin ligaz enzimini, ekspresyonu CRY1 promotorunca kontrol edilen CRY1 proteinine kaynaştırdık, böylece U2OS hücrelerinde rekombinant miniTurbo-CRY1 ekspresyonu ve salınımı gerçekleşti. Sirkadiyen saatin sıfırlanmasından sonra, kültür ortamına substrat olarak biyotin ekledik ve sübjektif gündüz ve gece zamanları için varsayılan CRY1 yakınında bulunan proteinlerin biyotinle etiketlenmesine izin verdik. Daha sonra streptavidin manyetik boncuklar kullanılarak biyotinlenmiş proteinleri indirerek kütle spektrometrisi ile kimliklendirdik. Sonunda farklı biyoinformatik araçlar kullanarak etkileşimlerin düzeyini analiz ettik. Özetle, ilk kez, çekirdek saat proteinlerinin etkileşiminin sirkadiyen zamandan daha kısa süreli bir çözünürlükte keşfedilebildiğini ve yeni geçici etkileşimlerin BioID tekniği ile tanımlanabileceğini gösteren bir sistem geliştirdik.Circadian rhythms are 24-hour oscillations produced by circadian clock that serve to coordinate internal time with the geological clock. The clock system is a main regulator of physiology, and its disruption has important consequences to health. A self-sustaining transcriptional-translational feedback loop mechanism composed of four factors generates molecular oscillations at transcriptome level. Even though the main basic mechanism of the molecular clock has been elucidated, many important aspects remain unexplored. The transient and dynamic interactions of the core clock factors have not been studied in detail. Because the circadian clock regulates 20-40% of proteome, the interactions of the clock proteins are putative targets of novel drug candidates. In order to identify the interactome of the core clock protein, CRY1 in the opposite circadian times, we exploited the proximity-dependent biotin identification (BioID) technique. For this, we fused miniTurbo biotin ligase enzyme to CRY1 protein, which was expressed under CRY1 promoter so the expression of the recombinant miniTurbo-CRY1 could oscillate in U2OS cells. After resetting of the circadian clock, we added biotin as substrate into culture media and allowed the proximity-dependent labeling of putative CRY1 interactome for the subjective day and night times. We then pulled down biotinylated proteins using streptavidin-magnetic beads and identified them by mass spectrometry. We finally analyzed the significance of the interactome using different bioinformatics tools. In summary, we showed for the first time, that interactome of core clock proteins can be discovered at sub-circadian resolution and novel transient interactions can be identified using BioID technique.