Lipaz üreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu, nitelendirilmesi ve gen kütüphanelerinin hazırlanması

Abstract

Lipazlar (triaçilgliserolester hidrolazlar E.C. 3.1.1.3), sort yıllaıda biyoteknolojik uygulamalar için yüksek potansiyelleriyle ilgi çeken enzimlerdir. Lipazlar doğal substratları olan suda çözünmeyen esterler ve trigliseritlerden başka enantio ve bölge seçici (regioselective) hidroliz reaksiyonlarını katalize etme yeteneğine sahiptirler. Bu özelliklerinden dolayı lipazlar, başta deterjan endüstrisi olmak üzere, gıda, kağıt, ilaç ve kozmetik endüstrisi gibi çeşitli alanlarda yaygın olarak kullanılmaktadırlar. Endüstriyel enzimlerin, yararlı biyokimyasalların, antibiyotik ve insektisitlerin kaynağı olarak geniş ölçüde kullanılan Bacillus soyları, kolay büyütülebilmeleri, proteinleri büyüme ortamına salgılamaları ve bazı türleri dışında, insan ve hayvanlarda hastalık oluşturmamaları nedeniyle homolog ve heterelog genlerin klonlanması ve ekspresyonu için de ileri derecede yararlı sistemlerdir. Bacillus cinsinin sanayide geniş öiçüde kullanımından dolayı, lipaz üreticisi yerel Bacillus soylarının izole edilmesi ve nitelendirilmesine yönelik çalışmalar artmaktadır. GYTE Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı Enzim Moleküler Genetiği Grubu ve Kızılay Pendik Tıp Merkezi Mikrobiyoloji Laboratuvarı'nın olanakları ve işbirliği ile yürütülen bu tez çalışmasında, yerel Bacillus soylarının çeşitli ortamlardan izole edilmesi, özgün morfolojik ve biyokimyasal özelliklerinden yola çıkılarak tanımlanması ve elde edilen bu yerel soylardan lipaz üreten soyların seçilmesi ve nitelendirilmesi amaçlanmıştır. Lipaz üreticisi Bacillus soylarının seçimi, lipaz seçici besi yerinde yapılmıştır. İzole edilen bakteriler, büyüme gereksinimleri, mikroskobik ve biyokimyasal özelliklerine göre tanımlanmıştır. Ön tiplendirmeleri gerçekleştirilen 23 soy arasından 1 1 tanesi, yapılan aktivite testleri sonucu en iyi lipaz üreticileri olarak seçilmiştir. Aktivite ve büyüme grafikleri hazırlanarak değerlendirilen bu soylardan 5 tanesi sınırlandırılmış kütüphane ve klonlama çalışmalarına alınmıştır.In recent years, lipases (triacylglycerolester hydrolases E.C. 3.1. raksta»* among the enzymes which have great attraction for their potential in biotechnological applications. Apart from their natural substrates, such as water-insoluble esters and triglycerids, lipases catalyse the enantio and regioselective hydrolysis and synthesis of a broad range of natural and synthetic esters. Due to their such properties, lipases have been widely used in food, detergent, paper, pharmaceutical and cosmetic industry. While they have been widely used as a source of industrial enzymes, fine biochemicals, antibiotics and insecticides, bacteria in genus Bacillus are desired systems for cloning and expression of homologous and heterologuos genes, due to their easy growth, secretion of proteins into the growth medium and, except some known species, non-pathogenicity for human and animals. Since microorganisms in genus Bacillus possess broad range of applications in industrial processes, the number of studies for the isolation and the characterization of the local Bacillus species has been increasing day-by-day. In this thesis work performed with the collaboration of Enzyme Molecular Genetics Group, Department of Biology, Gebze Institute of Technology and Bacteriology Laboratory, Pendik Medical Centre, Kızılay, the isolation and identification of the local strains according to the morphological and biochemical properties of Bacillus species and selection of lipase producing ones had been aimed. The selection of lipase producing Bacillus strains was done with rhodamine B containing growth medium. Isolated bacteria were identified according to their growth requirements, microscopic and biochemical properties. 11 of the pre-identified 23 strains were selected as the best lipase producers due to their activity test results. At the end of the evaluation of activity and growth plots of these 1 1 strains, five isolates were taken into genomic library and clonning studies.