Alkalen proteaz üreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu, nitelendirilmesi ve enzim üretiminin optimizasyonu

Abstract

Proteazlar, proteinlerin hidrolizini katalize eden hidrolitik enzimlerdir. Serin proteazların (E.C. 3.4.21) bir alt tipi olan "alkalen proteazlar" yüksek pH değerlerinde ve yüksek sıcaklıklarda kararlı olmalarından dolayı başta deterjan endüstrisi olmak üzere deri, gıda, ipek ve kağıt endüstrilerinde yaygın şekilde kullanılmaktadır. Alkalen proteazların, bakteri, küf ve mantar gibi çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilebilmesine karşın, endüstriyel uygulamalar için kullanılan alkalen proteazların eldesinde Bacillus türleri tercih edilmektedir. Son zamanlarda endüstriyel uygulamalar için elverişli özelliklere sahip yeni alkalen proteazları üreten Bacillus soylarının izolasyonuna yönelik çalışmaların sayısı artmaktadır. GYTE, Biyoloji Bölümü, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı, Enzim Moleküler Genetiği Grubu ve Kızılay Pendik Tıp Merkezi Mikrobiyoloji Laboratuarının olanakları ve işbirliği ile yürütülen bu tez çalışmasında yerel kaynaklardan alkalen proteaz üreticisi Bacillus türlerinin izolasyonu ve nitelendirilmesi amaçlanmıştır. Yerel kaynaklardan izole edilen Bacillus türlerinden süttozu içeren seçici besi yerinde kazein hidrolizi sonucu koloni çevresinde oluşan şeffaf bölgenin çapına göre seçilen 28 alkalen proteaz üreticisi izolatın benzeştikleri tür(ler) klasik mikrobiyolojik yöntemler kullanılarak önerilmiştir. 28 izolat içinden sıvı kültürde alkalen proteaz üretkenliği ile öne çıkan dokuz tanesinde optimal enzim üretimi için uygun koşullar belirlenmiş, enzim üretimi hücre büyümesine paralel olarak irdelenmiştir. Ayrıca bu dokuz izolat için ön tiplendirme çalışmalarında verilen tür ad(lar)ının doğrulanması amacıyla API 50 CHB/E ve VITEK Bacillus kitleri kullanılarak tanımlama çalışmaları yapılmıştır. Son aşamada, klasik tanımlama yöntemlerinden ve otomatik tanı sistemlerinden alınan sonuçlar birlikte değerlendirilmiş ve olası tür isimleri belirlenmiştir. Yapılan tiplendirme çalışmaları sonucunda tür ismi verilemeyen soylar için 16S rDNA dizi analizi çalışmaları başlatılmıştır. Tez çalışması kapsamında ayrıca sıvı besi yerinde enzim üretkenliği ile öne çıkan soylardan L13 tarafından üretilen alkalen proteaz enziminin ön nitelendirilmesi yapılmış; optimal sıcaklığının 50-55 °C olduğu ve pH 5,5-12 arasında kararlı olan bu enzimin maksimum aktivitesini pH 1 1,5 'ta gösterdiği belirlenmiştir.Proteases are hydrolytic enzymes which catalyzes the hydrolysis of the proteins. Alkaline proteases, sub-group of serine proteases (E.C. 3.4.21), which are stable under alkaline pH and high temperature are widely used in detergent, leather, food, silk and paper industries. Although alkaline proteases are produced by a wide range of microorganisms such as bacteria, fungi and molds, Bacillus species are the main preferred sources for these enzymes. Nowadays, the number of researches targeting the isolation of novel alkaline protease producing Bacillus species has been accelerated. In this thesis work, performed with the collaboration of Enzyme Molecular Genetics Group; Department of Biology, Gebze Institute of Technology and Bacteriology Laboratory, Pendik Medical Centre, Kızılay, the isolation and the identification of Bacillus species according to the morphological and biochemical properties and selection of alkaline protease producing strains among these isolates had been aimed. Among the locally isolated Bacillus species, 28 isolates were selected according to the radius of the clear zones around the colonies due to the hydrolysis of the casein in the skim-milk containing selective medium and then, the closest species names of these 28 Bacillus isolates were proposed according to the morphological and biochemical properties by performing classical microbiological techniques. For the nine strains chosen as the best enzyme producers among 28 isolates in liquid, growth conditions for optimal enzyme production were determined and, also, enzyme productivity parallel to cell growth was analysed. Then, these nine isolates were re-identified by API CHB/E and VITEK Bacillus kits in order to confirm the species names proposed at the pre- identification step. Finally, the species names of these nine isolates were given by comparing the results obtained from the three methods. For the isolates, which were not identified by these three methods, 16S rDNA sequence analysis studies have been started. In addition, the pre-characterization of the alkaline protease produced by strain LI 3 was done; and the optimal temperature, the optimal pH and pH stability range were found to be 50-55 °C, 1 1.5 and 5.5-12, respectively.