Effect of PYK gene deletions on shikimic acid pathway in Pseudomonas putida

Abstract

Şikimik asit (SA), hem bakterilerde hem de bitkilerde bulunan şikimat yolağında yer alan önemli bir ara metabolittir. Şikimik asit yolağı temel vitaminler, fenilalanin, tirozin ve triptofan gibi aromatik amino asitleri sentezler. SA, aromatik amino asitlerin (AAA) biyosentezinde bir ara bileşik olarak işlev göru?r ve influenza tedavisinde kullanılan bir ilaç olan oseltamivir fosfatın (Tamiflu) kimyasal sentezinin öncu?l maddesi olarak hizmet eder. Ayrıca, gallik asit, mukonik asit, salisilik asit ve antranilik asit gibi birçok ikincil metabolit SA yolağından u?retilmektedir. Bu metabolitlerden ilaç, kozmetik ve gıda endu?strilerinde yaygın olarak yararlanıldığından, çeşitli organizmalar söz konusu sektörlerde maliyeti du?şu?rmek ve çevre dostu u?retim elde etmek için kullanılmaktadır. P. putida (Pseudomonas putida), değerli kimyasalların u?retiminde veya çevresel kirleticilerin degradasyonunda rol oynayan yolakları barındırma kapasitesinden dolayı sentetik biyoloji ve metabolizma mu?hendisliği araştırmalarında sıklıkla tercih edilen konakçı bir organizmadır. Bu çalışmada, piruvat kinaz (pyk) genlerinin şikimik asit yolağına olan metabolik akış u?zerine etkisi incelenmiştir. Bu amaçla, P. putida genomu du?zenlenmiş ve pyk genleri I-SceI yöntemi kullanılarak silinmiştir. İlgili delesyonların bakterinin bu?yu?mesine, glikoz tu?ketimine ve SA yolağına doğru olan metabolik akışa etkileri hexR geni delesyona uğratılmış P. putida EM42 soyunda araştırılmıştır. Sonuçlar, pykA delesyonunun bakterinin hem bu?yu?me oranında hem de glikoz tu?ketiminde yavaşlamaya yol açtığını göstermiştir. Ayrıca, metabolit analiz sonuçları, pykA delesyonunun SA yolağına doğru akışın artırılmasında pykF'e görece daha baskın rol oynayabileceğine işaret etmiştir. Bu tez çalışması P. putida'da pyk genlerinin metabolik akışın fosfoenolpiruvat (PEP)'a doğru yönlendirilmesindeki rollerinin açığa kavuşturulması adına literatu?re katkı sağlayacaktır.Shikimic acid (SA) serves as a key intermediate in the shikimate pathway, which is found in both bacteria and plants. The shikimic acid pathway synthesizes essential vitamins and aromatic amino acids (AAA) like phenylalanine, tyrosine, and tryptophan. SA acts as an intermediate compound in the biosynthesis of AAA and serves as a precursor for the chemical synthesis of oseltamivir phosphate (Tamiflu), a drug used to treat influenza. Furthermore, many secondary metabolites such as gallic acid, muconic acid, salicylic acid, and anthranilic acid are produced through the SA pathway. Since these metabolites are widely utilized in the pharmaceutical, cosmetic, and food industries, various organisms are used in these sectors to reduce costs and achieve eco-friendly manufacturing. Pseudomonas putida (P. putida) is preferred as a chassis in synthetic biology and metabolic engineering research due to its capacity to harbor pathways designed to produce valuable chemicals or degrade/valorize environmental pollutants. In this study, we investigated the effect of pyruvate kinase (pyk) genes on metabolic flux to the AAA pathway. For this purpose, the P. putida genome was edited, and pyk genes were deleted using the I-SceI method. The effect of pyk gene deletions on bacterial growth, glucose consumption, and metabolic flux towards the SA pathway was investigated in a P. putida EM42 strain with a hexR-deleted gene. The results demonstrated that introducing pykA deletion into the hexR gene knockout strain led to a decrease in both growth rate and glucose consumption. Moreover, metabolite analysis results indicate that the deletion of pykA plays a more dominant role compared to pykF in increasing the flux towards the shikimate pathway. Due to the lack of detailed research on comparing pyks in P. putida, this research will contribute to the literature by elucidating the role of pyk genes in the metabolic flux towards the phosphoenolpyruvate (PEP).