RAD23 homolog a proteninin 26s proteozomu bağlantılı proteolitik yıkımdaki rolünü moleküler dinamik kullanılarak modellenmesi

Abstract

26S proteozomu bağlantılı proteolitik yıkımda kritik bir rol oynayan RAD23 Homolog A (RAD23A) proteininin fonksiyonu, N-terminal UBL ve C-terminal UBA domainleri arasındaki etkileşimlerle düzenlenen 'açık' ve 'kapalı' durumlar arasındaki konformasyonel geçişlere sıkı sıkıya bağlıdır. Bu çalışmada, RAD23A'nın yapısal dinamikleri ve bu geçişleri yöneten moleküler mekanizmalar, kapsamlı moleküler dinamik (MD) simülasyonları ve protein-protein docking analizleri ile detaylı olarak incelenmiştir. Bu kapsamda, GROMACS yazılımı kullanılarak yalın (apo) RAD23A, K122 kalıntısından ubikuitinlenmiş RAD23A ve K48-bağlantılı di-ubikitin (di-Ub) ile Rpn10 proteininin UIM domainini içeren üçlü kompleks sistemlerinin 400 nanosaniyeye (ns) varan sürelerde MD simülasyonları yürütülmüştür. Yapısal değişimler RMSD, RMSF, Yarıçap (Rg), SASA, PCA ve kümeleme analizi gibi metriklerle değerlendirilmiştir. Ayrıca RAD23A'nın potansiyel düzenleyicisi SIK2 kinazı ile etkileşimi, HADDOCK docking sunucusu ile modellenmiştir. Simülasyon sonuçları, yalın RAD23A'nın başlangıçtaki açık formdan, domainlerinin birbirine yaklaşmasıyla zamanla daha kompakt (kapalı) bir yapıya evrildiğini doğrulamıştır. Bu geçiş, özellikle 50-60 ns aralığında belirginleşmiş; Yarıçap (Rg) değerinde ~5.5 nm'den ~3.2 nm'ye, çözünebilir yüzey alanında (SASA) ise ~320 nm²'den ~220 nm²'ye bir düşüşle karakterize edilmiştir. K122 kalıntısından ubikuitinlenmiş RAD23A proteininde ise, bu kapanma eğiliminin yavaşladığı ve proteinin asimetrik bir hareketle daha esnek bir yapı sergilediği görülmüştür. En dikkat çekici bulgu ise, RAD23A'nın doğal bağlanma partnerleri olan K48-diUb ve Rpn10 ile oluşturduğu kompleks sisteminde, moleküller arası etkileşimlerin molekül içi kapanma eğilimini baskılayarak fonksiyonel olan açık formu stabil bir şekilde koruduğunun belirlenmesidir. Docking analizleri de bu bulguları destekleyerek, özellikle 50 ns ve 200 ns anlarındaki ara konformasyonların SIK2 ile en düşük HADDOCK skorlarına (-106.0 ve -102.7) sahip olduğunu göstermiştir. Sonuç olarak bu çalışma, RAD23A'nın işlevinin, post-translasyonel modifikasyonlar ve partner proteinlerle olan etkileşimler tarafından hassas bir şekilde kontrol edilen bir konformasyonel anahtarlama mekanizmasına dayandığını ve SIK2 kinazının bu düzenlemede potansiyel bir rol oynayabileceğini ortaya koymaktadır.The function of the RAD23 Homolog A (RAD23A) protein, which plays a critical role in 26S proteasome-associated proteolytic degradation, is tightly linked to conformational transitions between 'open' and 'closed' states, orchestrated by interactions between its N-terminal UBL and C-terminal UBA domains. In this study, the structural dynamics of RAD23A and the molecular mechanisms governing these transitions were investigated in detail through extensive molecular dynamics (MD) simulations and protein-protein docking analyses. For this purpose, MD simulations of up to 400 nanoseconds (ns) were conducted using GROMACS software for apo RAD23A, RAD23A ubiquitinated at the K122 residue, and a ternary complex system including K48-linked di-ubiquitin (di-Ub) and the UIM domain of Rpn10. Structural changes were evaluated using metrics such as RMSD, RMSF, Radius of Gyration (Rg), SASA, PCA, and cluster analysis. Furthermore, the interaction of RAD23A with its potential regulator, SIK2 kinase, was modeled using the HADDOCK docking server. Simulation results confirmed that apo RAD23A evolves from its initial open form to a more compact (closed) structure over time due to its domains approaching each other. This transition, which becomes prominent around 50-60 ns, was characterized by a decrease in the Radius of Gyration (Rg) from ~5.5 nm to ~3.2 nm and in the solvent-accessible surface area (SASA) from ~320 nm² to ~220 nm². In the K122-ubiquitinated RAD23A, this closing tendency was observed to be slower, with the protein exhibiting a more flexible structure through an asymmetric motion. Most notably, it was determined that in the complex formed with its natural binding partners, K48-diUb and Rpn10, RAD23A stably maintained its functional open form, as intermolecular interactions suppressed the intramolecular closing tendency. Docking analyses supported these findings, showing that intermediate conformations, particularly at 50 ns and 200 ns, had the lowest HADDOCK scores (-106.0 and -102.7, respectively) for SIK2 interaction In conclusion, this study reveals that the function of RAD23A is based on a conformational switching mechanism precisely controlled by post-translational modifications and interactions with partner proteins, and suggests that SIK2 kinase may play a potential role in this regulation.