Pluronik F68 polimerinin mezenkimal kök hücrelerin elektroporatik özelliklerine etkisi

Abstract

Gen ve hücre terapisi Alzheimer, Parkinson, Diyabet ve kanser gibi birçok hastalık için yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesinde umut verici olmaktadır. Yeni tedavileri geliştirmek için ideal kök hücreleri kullanmak ve etkili gen aktarım yöntemleri oluşturmak önemlidir. Yakın bir zamanda insan diş jerm kök hücrelerinin (İDJKH) hızlı çoğalma ve farklılaşma kapasitesine sahip mezenkimal kök hücre özellikleriyle aynı olduğu ispatlanmıştır. Elektroporasyon, gen ve hücre terapi uygulamalarında insan diş jerm kök hücrelerini transfekte etmek için etkili ve güvenli bir yöntemdir. Elektroporasyonun dezavantajı, elektroporasyon sonrasında hücre membranındaki hasardan kaynaklanabilecek olan hücre fizyolojisi, gen ekspresyonu ve çoğalmasındaki değişikliklerle ilişkili olabileceği gösterilmiştir. Pluronik F68 blok kopolimerinin hücre membranları ile etkileşime geçtiği ve stabilize ettiği belirlenmiştir.Bu çalışmada F68, insan diş jerm kök hücrelerinin elektroporasyonunda transfeksiyon verimini arttırmadaki etkisinde ilk kez kullanılmıştır. Sonuçlarımızda, F68'in varlığında pEGFP-N2 plasmidi ile transfekte edilen hücrelerin, F68'in uygulanmadığı durumda transfekte edilen grupla karşılaştırıldığında daha fazla oranda EGFP pozitif hücre varlığı ve daha düşük oranda hücre ölümü gözlemlenmiştir. Buna ek olarak, İDJKH, pEGFP ve pDsRed ile birlikte transfekte edildiğinde F68'in varlığındaki elektroporasyon sonrasında EGFP ve RFP pozitif hücrelerin sayısı belirlenmiştir. Embriyonik kök hücre markörleri olan Oct4 ve Klf4 genlerinin ekspresyonlarını analiz ettiğimizde F68 uygulanan hücreler, F68 uygulanmayan hücrelere göre daha yüksek ekspresyon seviyesine sahip olduğu bulunmuştur.Bu bulgulara göre; F68'in gen ve hücre terapisinde uygulanmak üzere etkili bir gen aktarım metodu sağlayarak mezenkimal kök hücrelerdeki transfeksiyon etkinliğini arttırdığı savunulabilir.Gene and cell therapies promise new treatment strategies for many diseases such as Parkinson, Alzheimer's disease, Diabetes and Cancer. In order to develop these new treatments it is important to use ideal stem cell and also establish efficient gene delivery protocols. Recently, it has been shown that Human Tooth Germ Stem Cells (HTGSCs) display Mesenchymal Stem Cell (MSCs) characteristics with high proliferation and differentiation capacity. It was shown that electroporation is a safe and efficient method to transfect HTGSCs for gene and cell therapy applications. The drawbacks of electroporation was shown to be related to altered cell physiology, gene expression and cell proliferation after electroporation which might stem from damages in cell membranes during electroporation. Pluronic F68 block co-polymer was determined to be interacting with cell membranes and stabilizing them during electroporation.In this study, F68 has been used for the first time to increase the transfection efficiency in electroporation of HTGSCs. Our results revealed that the cells transfected with pEGFP-N2 plasmid in the presence of F68 had the highest percentage of EGFP positive cells and showed lowest cell death when compared with control group where F68 was not used. Moreover when HTGSCs were transfected with both pEGFP-N2 and pDsRed (Red Fluorescent plasmid expressing plasmid), the number of both EGFP and RFP positive cells were detected after electroporation in the presence of F68. When we analyzed the expression of Embryonic Stem Cell marker genes Oct4 and Klf4 we have found that F68 treated cells has higher expression of Oct4 and Klf4 than non-treated cells.The results of the present study suggested that F68 might be used to increase transfection efficiency in MSCs providing a powerful non viral gene delivery method to be used in gene and cell therapy applications.