A-amilaz üreticisi yerel Bacillus soylarının izolasyonu, nitelendirilmesi ve enzim üretiminin optimizasyonu

Abstract

a-Amilaz (EC 3.2 J. 1 a-D-glukan-glukanhidrolaz), nişasta molekülündeki a- 1,4 glikozidik bağlarının rastgele hidrolizini kataliz ederek glukoz, dekstrin ve limit dekstrinleri oluşturan bir enzimdir. a~Amilazlar başta gıda olmak üzere, tekstil, deterjan ve kağıt endüstrilerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu uygulamalarda nişasta hidrolizinin gerçekleştirilmesi genellikle yüksek sıcaklıkta kararlı enzimlerin kullanılmasını gerektirdiğinden, uç sıcaklık koşullarında yaşayan mikroorganizmalar ve onların ürettiği enzimlere olan ilgi artmaktadır. Bacillus soyları gerek uç koşullarda yaşayabilme gerekse hücre dışına enzim salgılayabilme özelliklerinden dolayı a-amilaz enziminin üretiminde sıklıkla kullanılan mikroorganizmalar arasında yer almaktadır. GYTE Biyoloji Bölümü Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı Enzim Moleküler Genetiği Grubu ve Kızılay Pendik Tıp Merkezi Bakteriyoloji Laboratuvan'nın işbirliği ile yürütülen bu tez çalışmasında, a-amilaz üreticisi Bacillus soylarının yerel ekosistemlerden izole edilmesi, nitelendirilmesi ve enzim optimizasyonu amaçlanmıştır. Bu doğrultuda, yerel kaynaklardan alman örneklerden primer izolasyonu takiben, morfolojik ve mikroskobik olarak Bacillus cinsi üyesi olduğu düşünülen soyların a-amilaz üretkenlikleri nişasla-agarda test edilmiştir. Üretken soylar nişasta-agarda verdikleri halo çaplarına göre seçilerek manuel tanımlama testlerine alınmıştır. Tanımlama sonucu soyların benzeştiği tür isimleri belirlenmiş ve bu soylardan bazıları ile enzim aktivite çalışmaları yapılmıştır. Aktivite çalışmalarına alman soylar ayrıca yarı otomatik ve tam otomatik tanımlama killeri ile de isimlendirilmeye çalışılmıştır. Anılan tanımlama yöntemleri ile tür adı verilemeyen soylardan birisinin moleküler tiplendirme çalışmalarına alınması kararlaştırılmış, ilgili soyun genomik DNA' sı izole edilmiştir. 16S rDNA PCR ile çoğaltılmış ve dizi analizi çalışmaları yapılmıştır. Aynı soyun kültür ortamına salgıladığı a-amilazın ön nitelendirme çalışmaları yapılmış ve nişastanın bu enzim ile hidrolizi sonucu oluşan ürünler ince tabaka kromatografisi ile irdelenmiştir.a-amylase (E.C. 3.2.1.1 a-glucan-glucan hydrolase) is an enzyme which catalyses the hydrolysis of the a-1,4 glycosidic linkages of starch in a random manner, produces mainly glucose, dextrins and limit dextrins. These enzymes have been widely used especially food, textile, detergent and paper industries. Since, starch based processes in these applications require thermostable enzymes, the microorganisms living in extreme conditions and their enzymes are more favorable for researchers. Bacillus strains have been widely used as a source of these enzyme, due to their ability of surviving in extreme habitats and secretion of extracellular enzymes. In this thesis work performed with collaboration of Enzyme Molecular Genetics Group, Department of Biology, Gebze Institute of Technology and Bacteriology Laboratory, Pendik Medical Centre, Kızılay, isolation and identification of the a-amylase producing Bacillus strains from local areas and the optimization of the enzyme production have been aimed. In this respect, following the primary isolation, Bacillus strains were screened on starch-agar plates for their alpha amylase production capability. Among these strains, 35 isolates showing broader zone of clearance around individual colonies were choosen for the manual identification tests. The closest species name(s) for each of 35 Bacillus isolates has been determined according to the morphological and biochemical properties of Bacillus genus defined in Bergey's Manual of Systematic Bacteriology. Of the 35 pre-identified isolates, nine representing better enzyme production in the liquid culture conditions were taken into the enzymatic activity experiments to optimize the enzyme production. These nine isolates were further identified by using API 50 CHB/E kit and VITEK system. One of these strains which was unidentified with afore mentioned techniques, was selected for the molecular identification analysis and its genomic DNA was isolated. The 16S rDNA was amplified by PCR and then used for the DNA sequence analysis. Moreover, preliminary characterization studies of the a-amylase secreted into the culture medium by the same strain were achieved in order to determine biochemical properties of the enzyme and the reaction products of the starch hydrolysis by this enzyme have been evaluated by using thin layer chromatography.