Rekombinant geobacıllus kaustophılus L-asparajinaz II enziminin kinetik özelliklerinin belirlenmesi

Abstract

L-asparajinaz (EC 3.5.1.1) asparajin amino asidinin aspartik asit ve amonyağa dönüşümünü sağlayan enzimdir. Tümör hücreleri asparajini sentezleyemediklerinden kan dolaşımındaki asparajini kullanırlar. Bu sebeple, L-asparajinaz çeşitli kan kanseri tiplerinde kemoterapötik ajan olarak kullanılmaktadır. L-asparajinaz aynı zamanda yüksek sıcaklıkta pişirilen gıda maddelerinde oluşan ve L-asparajinin öncül maddesi olduğu akrilamidin gideriminde de kullanılmaktadır. Hem ilaç hem de gıda sektöründe yüksek sıcaklık ve geniş pH aralığında aktivitesini kaybetmeyen L- asparajinaz türlerine ihtiyaç duyulmaktadır. Bu nedenle ilgili tez çalışmasında, yüksek sıcaklıklarda yaşayan termofilik bakterilerden biri olan Geobacillus kaustophilus'a ait olan L-asparajinaz enziminin rekombinant olarak elde edilmesi ve kinetik ve termal kararlılık özelliklerinin çalışılması amaçlanmaktadır. Bu amaç doğrultusunda Geobacillus kaustophilus tip II L-asparajinaz geni pET22b(+) vektörüne BamHI-SalI enzim çifti kullanılarak klonlanmış ve E. coli Rosetta 2 (DE3) hücrelerinde ekspresyonu incelenmiştir. Gen ürününün N-terminalinde periplazmik lokasyonu sağlayan pelB sinyal dizisi ve C-terminalinde Hisx6 etiketi bulunması amaçlanmıştır. Böylelikle hücrede yüksek miktarda üretimi IPTG uyarımıyla sağlanan rekombinant L-asparajinaz enziminin periplazmik bölgede birikiminin enziminin saflaştırılmasına olan etkisinin karşılaştırılması amaçlanmıştır. N-terminalinde pelB sinyal dizisi taşıyan L-asparajinazın E. coli hücrelerinde ifade edilmediği görülmüştür. Çalışmalara pelB sinyal dizisi taşımayan rekombinant L-asparajinaz ile devam edilmiştir. Enzim Ni-NTA agaroz ile tek basamakta saflaştırılmıştır. Saflaştırılan L-asparajinaz enziminin optimum aktivite gösterdiği 55°C sıcaklıkta ve pH 8.5'ta L-asparajin substratı için Km değeri 0.49 mM olarak hesaplanmış; L-glutamin substratı içinse Km değeri 2.5 mM olarak hesaplanmıştır. Yapılan termostabilite deneylerinde enzimin 37°C ve 55°C sıcaklıklarında aktivitesini 6 saat boyunca kaybetmediği görülmüştür.L-asparaginase (EC 3.5.1.1) is an enzyme that converts asparagine amino acid to aspartic acid and ammonia. Since tumor cells cannot synthesize asparagine, they use asparagine in the bloodstream. L-asparaginase has been used as a chemotherapeutic agent in various types of blood cancer. L-asparagine is the precursor of acrylamide formed in high-temperature foodstuffs. Therefore, L-asparaginase is used in the mitigation of acrylamide. L-asparaginases, which are stable in high-temperature and wide pH range, are needed in the pharmaceutical and food sectors. Therefore, our aim is to obtain the recombinant L-asparaginase enzyme belonging to a thermophilic bacteria Geobacillus kaustophilus, and to study its kinetic and thermostability properties. For this purpose, Geobacillus kaustophilus type-II L-asparaginase gene was cloned into the pET22b(+) vector using BamHI-SalI enzymes and its expression in E. coli Rosetta 2 (DE3) cells was examined. The pelB signal sequence providing the periplasmic location at the N-terminus of the gene product and the Hisx6 tag at the C-terminus was intended. Thus, it was aimed to compare the effect of the accumulation of recombinant L-asparaginase enzyme in the periplasmic region on the purification of the enzyme. L-asparaginase bearing the pelB signal sequence at the N-terminal was not expressed in E. coli cells. The studies were continued with recombinant L-asparaginase without the pelB signal sequence. The enzyme was purified with Ni-NTA agarose. Km value for L-asparagine is 0.49mM at 55°C and pH 8.5, Km value for L-glutamine is 2.5mM. Thermostability experiments showed that the enzyme kept its activity at 37°C and 55°C for 6 hours.