pUC 19 vektörü üzerine klonlanmış B. licheniformis alkalen proteaz geninin E. coli'de eksprese edilmesi ve ekspresyonunun optimizasyonu

Abstract

Yüksek ya da düşük sıcaklık ve pH gibi koşullar altında optimal aktivite gösteren enzimler, biyoteknololojik yönden önem taşıdıkları gibi, bilimsel olarak da ilginçtirler. Deterjanlarda yüksek alkalen pH optimumları olan proteazlar tercih edilmekte, Bacillus licheniformis soyu, bu endüstriyel enzimin üretiminde yaygın şekilde kullanılmaktadır. Diğer bir Bacillus soyu olan ve gen klonlama ve ekspresyonu için yararlı bir sistem oluşturan B. subtilis ' in homolog ve heterolog proteinleri medyuma salgılaması ve patojen olmaması gibi nedenler, onu endüstriyel uygulamalar için çok ilgilenilen bir organizma kılmaktadır. Ancak genlerin klonlandığı plazmitlerin rekombinant B. subtilis kültürlerindeki kararsızlığı, endüstriyel uygulamalardaki temel problemi oluşturmaktadır. Büyüme ya da saklama sırasındaki plazmit kararsızlığından ve üretim süreci sonunda uygulanan inaktivasyon basamağına karşın spor bulundurma riskinden kaçınmak ve proteaz üretimini arttırmak üzere, B. licheniformis alkalen proteaz geni; bu çalışmanın ortak olarak sürdürüldüğü TÜBİTAK-GMBAE Enzim Moleküler Genetiği Grubu tarafından, bir E. coli plazmiti olan pUC 19 üzerine klonlanmıştır (Öztürk, S., 1, et.al.2002). B. licheniformis kökenli alkalen proteaz geninin E. co// 'deki ve B. subtilis'deki ekspresyonunun sağlanması, plazmit kararlılığının belirlenmesi ve ekspresyonun optimize edilmesi bu tez çalışmasının temel amaçlarını oluşturmuştur. pUC19 vektörü üzerinde lac promotoru altına klonlanmış olan B. licheniformis ATCC 53926 alkalen proteaz geni E. coli JM109 ve B. subtilis hücrelerine aktarılmış ve yapılan optimizasyon çalışmaları sonucunda en yüksek gen ekspresyonu E. coli JM109 soyunda, IPTG ile uyarımlı koşullarda gözlenmiş ve üretilen enzimin %60'ının kültür ortamına salgılandığı belirlenmiştir.Enzymes having optimal activity under extreme conditions, such as high or low temparature and pH, are not only biotechnologically important, but also scientifically interesting. Proteases that have high alkaline pH optimum are preferred as detergent additives and Bacillus licheniformis strains have been widely used in the production of these industrial enzymes. Bacillus subtilis, is a useful microorganism for gene cloning and expression in industrial applications due to its non-pathogenic character and secretion of proteins into the growht medium. However, the instability of the plasmids carrying genes of interest, in recombinant B. subtilis cultures is the major problem İn the industrial applications. In order to increase the protease production, and to get rid of plasmid instability occuring during growth or storage, and to avoid the risk of spore presence despite of inactivation step applied at the end of the production period, B. licheniformis alkaline Protease gene was cloned into the pUC19, which is an E.coli plasmid, by the Enzyme Molecular Genetics Group, TÜBİTAK, GMBAE with which collaboration was done during this thesis work (Öztürk, et al. 2002). The realization of the expression of B. licheniformis derived alkaline protease gene in E. coli and B. subtilis, the determination of the plasmid stability and the optimization of the expression are the main goals of this thesis work. Both E. coli JM109 and B. subtilis were transformed with B. licheniformis ATCC 53926 alkaline protease gene, which was cloned under the lac promoter on the pUC 19 vector. It has found that the highest gene expression level was observed in E. coli JM109 strain under IPTG-induced conditions, resultingin %60 of the enzyme produced secreted into the growth medium.