Coiled-coil domain containing 124 (Ccdc124) proteininin mikroRNAlar tarafından regülasyonunun incelenmesi

Abstract

Coiled-coil domain containing 124(Ccdc124) mantardan insana kadar tüm ökaryotlarda korunmuş bir proteindir. Yapılan çalışmalarda proteinin hücre bölünmesinin interfaz evresinde sentrozomda, post-anafaz evresinden sitokinetik bölünmeye kadar orta cisimcikte bulunduğu, bölünme dışında ise koşullara bağımlı olarak hücrenin farklı kompartımanlarında yer aldığı gösterilmiştir. Proteinin hücre içi fonksiyonunun belirlenmesi amacıyla yapılan çalışmalarda, CCDC124 geni, CRISPR/Cas9 yöntemi ile hedeflenip mutant hücre hatları oluşturulduğunda hücre bölünmesinde aksaklıklar gözlenmiş ve hücrelerin çok çekirdekli oldukları immün-boyama yöntemleri ile tespit edilmiştir. Yapılan veri tabanı araştırmalarında Ccdc124 proteini fonksiyon olarak RNA-bağlayıcı protein olarak geçmektedir. Ayrıca, Ccdc124 proteinin etkileşim partnerlerinin bulunmasına yönelik yapılan çalışmalar sonucunda, etkileştiği doğrulanan proteinlerin birçoğunun mikroRNA biyogenezi ve regülasyonunda görev aldığı görülmüştür. Hücre içerisinde farklı yollarla sentezlenen ve genellikle 19-22 nükleotit uzunluğunda bulunan mikroRNAlar, küçük, kodlanmayan ve öncü mRNAlar'ın 3'UTR bölgelerine bağlanarak hedef mRNAlar'ın degredasyonuna ya da inhibisyonuna neden olurlar. Dolayısıyla, mikroRNA molekülleri gen ekspresyonunu post-transkripsiyonel olarak düzenleyip hedef mRNA'ların hücre içerisinde işlevsel olarak susturulmalarına katkıda bulunurlar. Bu tez çalışması kapsamında, Ccdc124 proteinin ifadesinin mikroRNAlar tarafından düzenlenip düzenlenmediği araştırılmış, hedef mikroRNAlar veri tabanları, literatür çalışmaları ve deneysel çalışmalar tarafından belirlenip, Ccdc124 proteinin regülasyonundaki rolleri incelenmiştir. Bu çalışmada, hedef mikroRNA miR-138 yaklaşık %60 oranında düştüğü belirlenmiştir. İlerleyen basamaklarda olası miRNA bağlanma bölgeleri yönlendirilmiş mutagenez yöntemleri ile değiştirilerek süreçteki etkileri gözlemlenmiştir. Tez çalışmasının ikinci kısmında, seçilen farklı genlerin 3'UTR bölgelerinin mikroRNAlar tarafından regülasyonunun CCDC124-3'UTR'si varlığında etkilenip etkilenmediğine dair veriler elde edilmiştir.The Coiled-coil domain containing-124 (Ccdc124) protein is conserved in all eukaryotes, from fungi to human. In the studies, Ccdc124 protein is located at the interphase stage in the centrosome, from the post-anaphase phase to the cytokinetic division in the mid-body, and however, it has been shown that CCDC124 is present in different comparments of the cell depending on the conditions. In studies to determine the intracellular function of protein, the CCDC124 gene was targeted by CRISPR/Cas9 method and mutant cell lines were constructed and thus disorders were observed in cell division. In this case, multinucleated cells were identified by immunostaining methods. Ccdc124 protein is functionally referred to as RNA-binding protein. In addition, as a result of studies to find interaction partners of Ccdc124 protein, many of the proteins that it interacts have been found to be involved in microRNA biogenesis and regulation. MicroRNAs are synthesized in different ways within the cell, usually small non-coding 19-22 nucleotides in length, bind to 3'UTR regions of precursor mRNAs and cause degradation or inhibition of target mRNAs. Thus, microRNA molecules regulate gene expression post-transcriptionally and contribute to the functional silencing of target mRNAs within the cell. In this thesis, it was investigated whether the expression of Ccdc124 protein was regulated by microRNAs, target microRNAs were determined by databases, literature studies and experimental studies and their roles were determined in Ccdc124 protein regulation. In this study, the target microRNA was determined as mir-138 and it was determined that the expression of CCDC124-3'UTR decreases about 60% by luciferase assays. In the following steps, possible miRNA binding sites were altered by site directed mutagenesis methods and their effects in the process were observed. In the second part of this thesis, data were obtained whether the expression of different selected genes was affected by the presence of CCDC124-3'UTR.