Investigation of proteins associated with circadian rhythms using CRISPR-CAS9 technology and proximity labeling

Abstract

Sirkadiyen saat fizyoloji ve metabolizmada günlük ritimler üretir. Moleküler düzeyde, sirkadiyen saat, CLOCK ve BMAL1 transkripsiyon faktörlerinin sirkadiyen saatçe-düzenlenen genleri (CCG'ler) aktive ettiği bir transkripsiyon-translasyon geri besleme döngüsü (TTFL) tarafından üretilir. CCG'nin iki ürünü (CRYPTOCHROME ve PERIOD) daha sonra CLOCK-BMAL1 aktivitesini inhibe eder ve bu aktivasyon/inhibisyon, transkriptomun %10-20'sinde salınım oluşturur. BMAL1 genini düzenleyen yeni proteinleri bulmayı amaçladık. Bu amaçla BMAL1'in düzenleyici bölgesindeki proteinleri etiketlemeyi ve bunları kütle spektrometrisi (MS) ile tanımlamayı planladık. Teknik olarak modifiye edilmiş bir peroksidaz olan APEX2 enzimine birleştirilmiş olan katalitik olarak ölü bir RNA kılavuzlu nükleaz Cas9 (dCas9)'dan oluşan CASPEX sisteminin BMAL1 promotorunun yakınındaki proteinlerin biyotinlenmesi sağlandıktan sonra bunların zengileşitirilmesini takiben MS analizi ile tanımlanmasını kullandık. CASPEX ve BMAL1 promotorunu hedefleyen iki farklı sgRNA, HEK293T hücrelerinde stabil olarak eksprese edildi. Hücreler daha sonra CASPEX ekspresyonunu indüklemek için doksisiklin ile muamele edildi ve yakınlığa bağlı biyotinlenmeye izin vermek için fenol biyotin hücre kültür ortamına ilave edildi. Biyotinlemeden sonra, etiketlenmiş proteinler streptavidin boncukları kullanılarak saflaştırıldı ve MS ile tanımlandı. Adaylar, hedefleme yapmayan bir sgRNA eksprese eden hücre hattında tanımlanan proteinlerin çıkarılması ile temizlendi. Özetle, BMAL1 geninin promotor bölgesinde yeni proteinler belirledik. MS analiz sonuçlarına göre, bir genin promotoru ve RNA polimeraz ile etkileşime girdiği bilinen transkripsiyon faktörleri (MED19, LCOR gibi) tanımlanmıştır. Bu sonuçlar CASPEX sisteminin yeni sirkadiyen saat regülatör proteinlerinin tanımlanmasında başarıyla kullanılabileceğini göstermektedir.The circadian clock generates daily rhythms in physiology and metabolism. At the molecular level, the circadian clock is generated by a transcription-translation feedback loop (TTFL) where CLOCK and BMAL1 transcription factors activate circadian clock-regulated genes (CCGs). The products of two of CCGs (CRYPTOCHROME and PERIOD) then inhibit CLOCK-BMAL1 activity and this activation/inhibition generates oscillations in 10-20% of transcriptome. We aimed at finding novel proteins that regulate BMAL1 gene. For this aim, we planned to label proteins in the regulatory region of BMAL1 and identify them by mass-spectrometry (MS). We used a catalytically-dead RNA-guided nuclease Cas9 (dCas9) fused to an engineered peroxidase APEX2 (CASPEX) to biotinylate proteins in the proximity of BMAL1 promoter for subsequent enrichment and identification by MS analysis. CASPEX and two different sgRNAs targeting BMAL1 promoter were stably expressed in HEK293T cells. Cells were then treated with doxycycline to induce the expression of CASPEX and phenol biotin was added into the medium to let proximity-dependent biotinylation to occur. After biotinylation, labeled proteins were purified using streptavidin-coated beads and identified by MS. The candidates were cleaned by excluding the proteins identified in a non-targeting sgRNA expressing cell line. In summary, we identified novel proteins in the promoter region of the BMAL1 gene. According to MS analysis results, transcription factors (such as MED19, LCOR) which are known to interact with the promoter of a gene and RNA polymerase were identified. These results show that the CASPEX system is effective for the identification of novel circadian clock regulatory proteins.