Effect of PER2 interactome on PER2 stability

Abstract

Canlılar soylarını devam ettirebilmek için dünyanın dönüşü, gece-gündüz döngüsü gibi faktörlere uyum sağlamak zorundadırlar. Sirkadiyen ritim bu adaptasyon sonucu oluşan, hücrelerin fizyolojik fonksiyonlarını gen anlatımını düzenleyerek kontrol ederek 24 saatlik bir ritim oluşturan ve neredeyse bütün canlılarda bulunan bir mekanizmadır. Bu mekanizmada görevli olan proteinler arasında hücrelerdeki hücre hayatta kalması ve çoğalması gibi önemli fonksiyonlara sahip birçok genin aktivasyonunu (BMAL1 ve CLOCK) ve inhibisyonunu sağlayanlar (PER ve CRY) bulunur. Birçok hastalık ve jetlag gibi rahatsızlık verici durumların sirkadiyen ritmin bozulmasıyla tetiklendiği bulunmuştur. PER2 proteini sirkadiyen ritimde gen anlatımını negatif etkileyici rol oynayan ritmik bir proteindir ve ritmik düzenlenmesinin aksaması birçok hastalık ile ilişkilendirilmiştir. Düzgün çalışan bir sirkadiyen ritim mekanizması sağlıklı bir protein etkileşim ağı gerektirir ve PER2 proteini de başka proteinlerle etkileşime girerek hücre içindeki seviyesini ve lokasyonunu düzenler. Bu tezde PER2'nin kütle spektrometresi ile U2OS hücrelerinde etkileştiği tespit edilen proteinlerin HEK293T hücre hattında transfeksiyon yolu ile fazla anlatımı sağlanmıştır. Daha sonra bu proteinlerin fazla üretildiği ortamda PER2 proteinin stabilitesi western blot analizi , BMAL1 promotörünün etkinliği ise lusiferaz tekniği kullanılarak değerlendirilmiştir. Öncü deneyler PER2 stabilitesinin etkileştiği proteinler sonucu azaldığını gösterse de sonuç olarak PER2 proteinin stailitesinin anlamlı olarak değiştiren bir hedef protein bulunamamıştır. Ancak, PER2 nin etkileştiği PAICS, CCT2 ve NME1 proteinlerinin BMAL1 promotör etkinliğini artırdığı gözlemlenmiştir.Living things must adapt to environmental factors such as the spinning of the earth and the day-night cycle. Circadian rhythm is a mechanism born from this adaptation that creates a 24 hours rhythm of gene expression that controls cellular physiology and is present in almost every living thing. There are proteins that activate (BMAL1 and CLOCK) and inhibit (PER and CRY) the expression of many genes important functions such as cell survival and proliferation among the proteins take place in this mechanism. It was found that many diseases and disorders such as jetlag are triggered by the disruption of the circadian rhythm. PER2 is a rhythmic protein that negatively regulates gene expression in circadian rhythm and is associated with many diseases when arrhythmic. A healthy circadian rhythm requires a proper network of protein interactions and PER2 protein organizes its amount and cellular location by interacting with other proteins. In this thesis, The overexpression of proteins that are detected to interact with PER2 by mass spectrometry in the U2OS cell line is achieved in HEK293T cells. Then, PER2 stability by western blot and the change in BMAL1 promoter by luciferase assay were evaluated. Even though initial experiments suggested a decrease in PER2 stability as a result of proteins interacting with PER2, no significant change in PER2 stability is detected when all experiments are considered. However, PAICS, CCT2, and NME1 proteins that PER2 interacts with are found to increase the BMAl1 promoter activity.