Therapeutic effect of potential c-MET inhibitors on pancreas cancer cell lines

Abstract

Pankreas duktal adenokarsinomu (PDAC), tanı anında sıklıkla ileri evrede olması ve agresif seyri nedeniyle en ölümcül kanserler arasında yer almaktadır. 2018'de kanserle ilişkili ölümlerin dördüncü önde gelen nedeni olan pankreas kanserinin, 2030 yılına kadar kanser ölümlerinin ikinci önde gelen nedeni olması beklenmektedir. Bu kanseri türünün moleküler düzeydeki önemli düzenleyicilerinden biri, hepatosit büyüme faktörü (HGF) tarafından aktive edilen bir reseptör tirozin kinaz olan c-MET proteinidir. HGF/c-MET sinyallemesinin artışı, hücre proliferasyonu, invazyon, metastaz ve tedaviye dirençle ilişkilidir. Pankreatik stellat hücreler (PSC), PDAC mikroçevresinde c-MET proteininin ligandı olan HGF'nin ana kaynağıdır. Bu nedenle c-MET'in pankreas kanserinin tedavisinde potansiyel bir hedef olduğu bilinmektedir. Bu tez çalışmasında, triazolopiridazin türevi yeni c-MET inhibitörü adayından BH836, BH733, BH851, BH867, BH892 ve BH952 moleküllerinin, insan pankreas kanseri hücre hatları MIA PaCa-2 (KRAS^G12C) ve PANC-1 (KRAS^G12D) üzerindeki terapötik etkileri değerlendirilmiştir. Ayrıca klinikte onaylı c-MET inhibitörü Cabozantinib referans molekül olarak kullanılmıştır. Hücre canlılığını belirlemek için MTT testi, uzun vadeli çoğalma kapasitesini ölçmek için koloni oluşum testi, tedavi koşulları altında hücre sağ kalımını değerlendirmek için sağkalım testi, hücresel stres yanıtlarını analiz etmek amacıyla floresan boyama (reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi, mitokondriyal membran potansiyeli, lipid birikimi ve ölü hücrelerin tespiti dahil) ve protein ekspresyon düzeylerini değerlendirmek için Western blot analizleri uygulanmıştır. BH836 ve BH851, MTT ve koloni oluşturma testlerinde en güçlü antiproliferatif etkiyi gösterirken; BH733 ve BH952 orta düzeyde sitotoksisite sergilemiştir. BH952, her iki hücre hattında 10 µM'den itibaren anlamlı canlılık kaybına neden olmuştur. Cabozantinib, her iki hücre hattında doz-bağımlı hücre canlılığı azalması sağlamış; ancak koloni oluşumunu tamamen baskılayamamıştır. Sağkalım testi sonuçları, BH851 ve BH836'nın MIA PaCa-2 hücrelerinde hücre yaşamını azalttığını, BH733, BH952 ve Cabozantinib'in ise PANC-1 hücrelerinde zaman ve doza bağlı olarak daha etkili olduğunu gösterdi. Floresan boyamalarda BH836, BH733 ve BH851, ROS üretimini artırmış ve mitokondriyal membran potansiyelini PANC-1'a uygulanan BH851 molekülü hariç düşürermektedir. BH952, düşük dozda yüksek düzeyde ROS oluşturmuş, yüksek dozda ise belirgin hücre ölümüne yol açmıştır. Cabozantinib'de mitokondriyal aktivitede hücre sayısı azalsada belirgin bir azalış gözlemlenmemiştir ancak nükleer değişiklikler izlenmiştir. BH836, BH733, ve BH851 her iki hücre hattında ve BH867 MIA PaCa-2 hücresinde doza bağlı olarak lipogenez artışına neden olduğu görülmüştür. Ancak, BH952, lipid birikimini baskılayıcı etki göstermiştir. Western blot analizleri, BH836 ve BH733'ün EGFR ve AKT düzeylerini azalttığını; BH851'in c-PARP artışı ile apoptoz belirteçlerini güçlendirdiğini göstermiştir. BH952, özellikle PANC-1 hücrelerinde MET yolak proteinlerini baskılamıştır. Cabozantinib benzer moleküler yolakları hedef almış, ancak bazı yeni inhibitörlere kıyasla daha sınırlı etki göstermiştir. Sonuçlar, BH836 ve BH851'in PDAC hücrelerinde güçlü antitümör etkiler oluşturduğunu; BH733 ve BH952'nin ise daha sınırlı fakat anlamlı biyolojik yanıtlar tetiklediğini göstermektedir. Bu bulgular, c-MET hedefli yeni inhibitörlerin pankreas kanseri tedavisindeki potansiyellerine dair önemli ön veriler sunmaktadır.Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is among the most lethal cancers due to its aggressive course and frequent advanced stage at the time of diagnosis. Pancreatic cancer, which was the fourth leading cause of cancer-related deaths in 2018, is expected to become the second leading cause of cancer deaths by 2030. One of the important regulators of this type of cancer at the molecular level is the c-MET protein, a receptor tyrosine kinase activated by hepatocyte growth factor (HGF). Increased HGF/c-MET signaling is associated with cell proliferation, invasion, metastasis, and resistance to treatment. Pancreatic Stallette Cells (PSCs) are the main source of HGF, the ligand of the c-MET protein, in the PDAC microenvironment. Therefore, c-MET is known to be a potential target in the treatment of pancreatic cancer. In this thesis study, the therapeutic effects of novel triazolopyridazine derivative c-MET inhibitor candidates, BH836, BH733, BH851, BH867, BH892 and BH952, on human pancreatic cancer cell lines MIA PaCa-2 (KRAS^G12C) and PANC-1 (KRAS^G12D) were evaluated. In addition, clinically approved c-MET inhibitor cabozantinib was used as a reference molecule. MTT assay to determine cell viability, colony formation assay to measure long-term proliferative capacity, survival assay to assess cell survival under treatment conditions, fluorescent staining to analyze cellular stress responses (including ROS production, mitochondrial membrane potential, lipid accumulation, and detection of dead cells), and Western blot analyses to evaluate protein expression levels were performed. While BH836 and BH851 showed the strongest antiproliferative effect in MTT and colony formation tests; BH733 and BH952 exhibited moderate cytotoxicity. BH952 caused significant loss of viability in both cell lines starting from 10 µM. Cabozantinib caused dose-dependent cell viability reduction in both cell lines; however, it could not completely suppress colony formation. Survival assay results showed that BH851 and BH836 reduced cell survival in MIA PaCa-2 cells, while BH733, BH952, and Cabozantinib were more effective on PANC-1 cells in a time- and dose-dependent manner. In fluorescent stainings, BH836, BH733 and BH851 increased ROS production and decreased mitochondrial membrane potential except for BH851 molecule applied to PANC-1. BH952 generated high levels of ROS at low doses and caused significant cell death at high doses. No significant decrease was observed in mitochondrial activity in cabozantinib despite the decrease in cell number, but nuclear changes were observed. BH836, BH733, and BH851 were observed to increase lipogenesis in both cell lines and BH867 MIA PaCa-2 cell line in a dose-dependent manner. However, BH952 showed suppressive effect on lipid accumulation. Western blot analyses showed that BH836 and BH733 decreased EGFR and AKT levels; BH851 increased c-PARP and enhanced apoptosis markers. BH952 suppressed MET pathway proteins specifically in PANC-1 cells. Cabozantinib targeted similar molecular pathways but showed more limited effect compared to some new inhibitors. The results show that BH836 and BH851 produced strong antitumor effects in PDAC cells; BH733 and BH952 triggered more limited but significant biological responses. These findings provide important preliminary data for the potential of new c-MET-targeted inhibitors in the treatment of pancreatic cancer.