Development and characterization of bioactive molecule-loaded pla/spirulina-based nanoparticles produced by double emulsion technique

Abstract

İnsan derisi, dış çevresel etkilere karşı koruyucu bir bariyer görevi görmesinin yanı sıra, biyolojik olarak aktif moleküllerin taşınmasını sınırlayan karmaşık ve çok katmanlı bir yapıya sahiptir. Bu durum, hidrofilik ve yapısal olarak hassas biyomoleküllerin dermal uygulamalarda hedef dokulara etkili bir şekilde iletilmesini özellikle zorlaştırmaktadır. Hücresel enerji metabolizması, DNA onarımı ve yaşlanma süreçlerinde kritik bir rol oynayan Nikotinamid Adenin Dinükleotid (NAD+), bu sınırlamalar nedeniyle doğrudan dermal uygulamalarda stabilite ve biyoyararlanım sorunları sergilemektedir. Bu nedenle, NAD+'yı biyolojik aktivitesini koruyarak hedef hücrelere iletebilen yenilikçi ve biyolojik olarak uyumlu taşıyıcı sistemler geliştirmeye ihtiyaç vardır. Bu tez çalışmasının amacı, sürdürülebilir ve biyolojik olarak uyumlu bir hibrit nanotaşıyıcı sistem geliştirmek ve bu sistemi NAD+ gibi hidrofilik bir biyomolekülün dermal hücrelere iletilmesi için değerlendirmektir. Bu bağlamda, su/yağ/su (W/O/W) çift emülsiyon yöntemi kullanılarak poli(laktik asit) (PLA) ve Spirulina platensis bazlı nanopartiküller üretildi ve optimize edildi. Farklı Spirulina oranlarına sahip nanopartiküller, partikül boyutu, polidispersite indeksi, morfoloji, kimyasal yapı, kapsülleme kapasitesi, salınım profili ve stabilite açısından kapsamlı bir şekilde karakterize edildi. Elde edilen sonuçlara göre, optimize edilmiş nanopartiküllerin ortalama boyutunun ~120–135 nm aralığında olduğu ve düşük polidispersite indeksleriyle homojen bir dağılım sergilediği belirlendi. Nanopartiküllerin biyolojik performansı, insan keratinosit (HaCaT), dermal fibroblast (HDF) ve endotel (HUVEC) hücre hatları kullanılarak MTT, hücre çoğalması ve yara iyileşmesi testleri ile değerlendirildi. PLA ve PLA/Spirulina bazlı nanopartiküllerin 1-5 µg/mL konsantrasyon aralığında hücre canlılığı üzerinde sitotoksik bir etkiye sahip olmadığı ve genel olarak yüksek biyouyumluluk sergilediği bulunmuştur. Nanopartiküllerin düşük ve orta dozlarda uygulanmasının, özellikle fibroblast ve endotel hücrelerinde hücre çoğalmasını desteklediği gözlemlenmiştir. Yara iyileşmesi analizleri, Spirulina içeren nanopartiküllerin hücre göçünü ve yara kapanma hızını zamana ve doza bağlı olarak olumlu yönde etkileyebileceğini ortaya koymuştur. Çalışmanın son aşamasında, optimize edilmiş PLA ve PLA/Spirulina nanopartikülleri NAD+ ile yüklenmiş ve bu sistemlerin hücresel etkileri değerlendirilmiştir. 75 µg/mL konsantrasyonda uygulanan NAD+ yüklü nanopartiküllerin fizikokimyasal stabilitelerini korudukları ve özellikle HUVEC hücrelerinde metabolik aktiviteyi önemli ölçüde etkiledikleri belirlenmiştir. Spirulina içeren NAD+ yüklü nanopartiküllerin, antioksidan ve biyolojik olarak aktif bileşenlerin katkısıyla hücresel yanıtları daha belirgin şekilde modüle ettiği gözlemlenmiştir. Bu tez çalışmasında, geliştirilen PLA/Spirulina bazlı hibrit nanopartikül sisteminin, NAD+ gibi hidrofilik ve hassas biyomoleküllerin stabil taşınması için uygun, biyolojik olarak uyumlu ve sürdürülebilir bir platform sunduğu gösterilmiştir. Bulgular, bu nanotaşıyıcı sistemin dermal rejenerasyon, yara iyileşmesi ve yaşlanma karşıtı uygulamalar için umut vadeden bir aday olduğunu ortaya koymaktadır.Human skin, in addition to acting as a protective barrier against external environmental influences, possesses a complex and multilayered structure that limits the transport of biologically active molecules. This makes it particularly difficult to effectively deliver hydrophilic and structurally sensitive biomolecules to target tissues in dermal applications. Nicotinamide adenine dinucleotide (NAD?), which plays a critical role in cellular energy metabolism, DNA repair, and aging processes, exhibits stability and bioavailability problems in direct dermal applications due to these limitations. Therefore, there is a need to develop innovative and biocompatible carrier systems that can deliver NAD? to target cells while preserving its biological activity. The aim of this thesis study is to develop a sustainable and biocompatible hybrid nanocarrier system and to evaluate this system for the delivery of a hydrophilic biomolecule such as NAD? to dermal cells. In this context, poly(lactic acid) (PLA) and Spirulina platensis based nanoparticles were produced and optimized using the water/oil/water (W/O/W) double emulsion method. Nanoparticles with different Spirulina ratios were comprehensively characterized in terms of particle size, polydispersity index, morphology, chemical structure, encapsulation capacity, release profile, and stability. According to the results obtained, it was determined that the average size of the optimized nanoparticles was in the range of ~120–135 nm and exhibited a homogeneous distribution with low polydispersity indices. The biological performance of the nanoparticles was evaluated using human keratinocyte (HaCaT), dermal fibroblast (HDF), and endothelial (HUVEC) cell lines with MTT, cell proliferation, and wound healing tests. PLA and PLA/Spirulina-based nanoparticles were found to have no cytotoxic effect on cell viability in the concentration range 1 - 5 µg/mL and generally exhibited high biocompatibility. Application of nanoparticles at low and medium doses was observed to support cell proliferation and particularly in fibroblasts and endothelial cells. Wound healing analyses revealed that Spirulina-containing nanoparticles could positively influence cell migration and wound closure rate in a time- and dose-dependent manner. In the final stage of the study, optimized PLA and PLA/Spirulina nanoparticles were loaded with NAD+, and the cellular effects of these systems were evaluated. It was determined that NAD+-loaded nanoparticles applied at a concentration of 75 µg/mL maintained their physicochemical stability and significantly affected metabolic activity, especially in HUVEC cells. It was observed that NAD+-loaded nanoparticles containing Spirulina modulated cellular responses more significantly with the contribution of antioxidant and biologically active components. In this thesis study demonstrates that the PLA/Spirulina-based hybrid nanoparticle system developed offers a suitable, biocompatible, and sustainable platform for the stable transport of hydrophilic and sensitive biomolecules such as NAD+. The findings reveal that this nanocarrier system is a promising candidate for dermal regeneration, wound healing, and anti-aging applications.