Model bitki Arabidopsis thaliana'nın kriyoprezervasyon sürecinde gerçekleşen transkripsiyon sonrası düzenlenmelerin miRNA'lar ile taranması

Abstract

Kriyoprezervasyon, -196?'ta sıvı azot (SA) içerisinde bitki germplazmasının korunabilmesi için güvenli ve uygun maliyetli uzun süreli bir saklama tekniğidir. Kriyoprezervasyon sırasında, in vitro kültürlenmiş bitki hücreleri ve dokuları kuraklık, soğuk ve oksidatif gibi çeşitli abiyotik streslere maruz kalırlar. Bununla birlikte, şimdiye kadar, kriyoprezervasyon sonrası hayatta kalmayı etkileyen moleküler düzenleyici mekanizmalar, bitkilerde net bir şekilde açıklanamamıştır. mikroRNA'lar (miRNA'lar) bitkilerin gelişim sürecinde gen anlatımını düzenlemenin yanında, aynı zamanda stres durumunda gen anlatımını transkripsiyon sonrası degredasyon yolu ile kontrol eder. Bu nedenle, bu tez çalışması kapsamında, farklı çimlenme sürelerinde (48 ve 72 saat) çimlendirilmiş Arabidopsis thaliana'da kriyoprezervasyonun farklı aşamalarında miRNA tabanlı transkripsiyon sonrası düzenlemeleri ortaya çıkarmak amaçlanmıştır. Taranan 10 miRNA ve bunların hedef genleri arasında, kriyoprezervasyon aşamalarındaki maruziyetine göre test edilen iki çimlenme süresinde tespit edilen farklılaşan anlatım düzeyleri bakıldığında, 6 miRNA (miR393, miR397, miR398, miR159, miR169 ve miR172) 48 saat grubunda karışık bir artış-azalış gösterirken, 6 miRNA (miR397, miR398, miR159, miR169, miR172 ve miR408) 72 saat grubunda kontrole kıyasla OD (Ozmokoruma-Dehidratasyon) ve LD (Sıvı Azot-Dilüsyon) örneklerinde önemli ölçüde anlatımı azalmıştır. En çarpıcı gen anlatım değişikliği miR393'te, 48 saat LD örneklerde 15 kat artış ile elde edilirken, kriyoprezerve edilmiş 72 saat örneklerde nispeten daha düşük miktarda artış (2 kat) kaydedilmiştir. Ayrıca miR393'ün hedef genleri TIR1 ve HOS1'in anlatımında eşzamanlı azalış ve 48 saat örneklerinde HOS1 tarafından düzenlenen CBF1 ve CBF3 ve bunların alt genlerinin (COR15 ve COR47) anlatım düzeylerinde artış gözlenmiştir. Tez çalışmasında kriyoprezervasyon sırasında miRNA'ların, hedef genlerinin ve bunlarla etkileşim halinde olan soğuk ilişkili genlerin anlatım düzeylerindeki değişimlerin, başarılı kriyoprezervasyon protokollerinin geliştirilmesinde önemli bir rol oynadığı tespit edilmiştir.Cryopreservation is a safe and cost-effective long-term storage technique which helps to conserve plant germplasm in liquid nitrogen (LN). During cryopreservation, in vitro cultured plant cells and tissues exposure to several stresses among which drought, cold and oxidative are the main abiotic stresses that seriously affect plant growth in cryostorage. However, up to now, the molecular regulatory mechanisms that effect survival after cryopreservation have not been satisfactorily elucidated in plants. microRNAs (miRNAs) not only regulate gene expression in developmental process of plants, but also control gene expression in stress condition by post-transcriptional degradation. Thus, the aim of the study concerned to reveal out miRNA-based post-transcriptional regulations during different stages of cryopreservation in 48-h and 72-h in vitro germinated Arabidopsis thaliana. Among the screened 10 miRNAs and their selected target genes, differential expression levels detected in two tested germination time according to exposure of cryopreservation stages, as 6 miRNAs (miR393, miR397, miR398, miR159, miR169 and miR172) showed a mixed pattern in 48-h germinated seedlings while 6 miRNAs (miR397, miR398, miR159, miR169, miR172 and miR408) were significantly down-regulated in OD (Osmoprotection-Dehydration) and LD (Liquid nitrogen-Dilution) samples in comparison to control in 72-h germinated ones. The most striking expression changes was obtained in miR393 as it was up-regulated 15-fold in LN treated 48-h seedlings while relatively lower amount induction (2-fold) was recorded in cryopreserved 72-h seedlings. The concominant down-regulation of its target TIR1 and HOS1 expression and up-regulation of CBF1 and CBF3 and their downstream genes (COR15 and COR47) were also observed in cryopreserved 48-h germinated seedlings. Thus, the alteration of expression levels of cold induced genes related-miRNAs and their target genes play a crucial role in development of successful cryopreservation protocols.