Nitrit biyosensörü geliştirilmesi için rekombinant nitrit redüktaz enzimi üretimi

Abstract

Bu tez çalışmasında, nitrit ölçümünde kullanılacak bir biyosensör geliştirmek amacıyla biyoajan olarak görev yapacak olan nitrit redüktaz enzimine (NirB) ait gen klonlanmış, saflaştırılmış ve amperometrik biyosensör elektrodunda test edilmiştir. Escherichia coli (E. coli) NirB geni bir saflaştırma vektörü olan pET28a vektörüne polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ile çoğaltılarak yerleştirilmiştir. Rekombinant vektör E. coli BL21 hücrelerine aktarıldıktan sonra elde edilen trasformant kolonilerden nitrit redüktaz B enzimi saflaştırılmıştır. Enzimin oksijen varlığında agrede olduğu ve betamerkaptoetanol varlığında indirgendiği ve aktif formuna kavuştuğu belirlenmiştir. Enzimin üretim şartları ve aktivitesi optimize edilmiş ve KM ve VMAX değerleri hesaplanmıştır. KM değeri 1.056 mM ve VMAX değeri 0.293 ?mol/mg·dk'dır. Enzim aktivitesi nitritteki azalmanın Griess metodu kullanılarak ölçülmesi suretiyle belirlenmiştir. Enzimin spesifik aktivitesi 8.518 ?mol/mg.protein.dk olarak hesaplanmıştır. Deney sonuçlarına göre enzim; pH 7.5 ve 37°C'de 5 dakikalık reaksiyon süresi ile en yüksek aktiviteyi göstermektedir ve 4°C'de saflaştırıldığı gün tetramere dönüşmesine izin vermeden ?ME eklenip saklandığında aktivitesini daha uzun süre koruduğu tespit edilmiştir. Aynı zamanda enzim 25mM kadminyum varlığında saklandığında, kadminyum iyonunun enzimi koruyarak aktivite kaybını engellediği gözlenmiştir. Sodyum nitrat ve sodyum format gibi iyonların yüksek konsantrasyonları ise enzimin aktivitesini düşürmektedir. Enzim poligluteraldehit ve pirol varlığında altın elektrot yüzeyine tutuklanarak amperometrik ortamda çalışan bir elektrot üretilmiştir. Biyosensörün artan nitrit konsantrasyonlarında (0.5mM ve 3.5mM) dönüşümlü voltametri (CV) grafiği kaydedilmiş ve enzimin amperometrik bir nitrit biyosensörü için uygun bir ajan olduğu gösterilmiştir.In this study, gene for nitrite reductase enzyme (NirB) which will serve as a bioagent to develop a biosensor to be used in nitrite measurement, was cloned, purified and tested in amperometric biosensor electrode. Escherichia coli (E. coli) nirB gene was cloned in the pET28a vector by amplifying with polymerase chain reaction (PCR). Nitrite reductase B enzyme was purified from the trasformant colonies obtained after the constructed vector was transferred to the E. coli BL21 cells. It has been determined that the enzyme was aggragated in the presence of oxygen and it was reduced in the presence of Beta mercaptoethanol and gains its active form. The production conditions and activity of the enzyme has been optimized and KM and VMAX values were calculated to be 1.056 Mm and 0.293 ?mol/mg·min, respectively. The enzyme activity was determined by measurement of the decrease in nitrite concentration using the Griess Method. The specific activity of the enzyme was calculated as 8.518 ?mol/mg.protein.min. Experiments related to the optimization showed that highest activity occured at 7.5 and 37°C with a 5 minute reaction time, and it was found that when the ?ME was added just after purification and enzyme stored at 4°C, it protected its activity for a longer period of time. At the same time, when the enzyme was stored in the presence of 25mM cadminium, it has been observed that the cadminum ion prevented loss of activity by preserving the enzyme. High concentrations of some ions such as sodium nitrate and sodium formate reduced the activity of the enzyme. For biosensor preparation the enzyme Nirb was immobilized with polygluteraldehyde and pyrole on gold electrode, and measurements were performed in an amperometric environment. The cyclic voltammetry (CV) was recorded with increasing nitrite concentrations (0.5mM and 3.5mM). The enzyme was shown to be a suitable agent for an amperometric nitrite biosensor fabrication.