Onkofetal ROR1 proteinin hepatokarsinogenezdeki rolünün araştırılması

Abstract

Hepatoselüler karsinoma (HCC) en sık görülen ölümcül primer karaciğer kanseri olmasına karşın, erken tanı ve tedavisindeki gelişmeler sınırlı kalmaktadır. Literatürde, reseptör tirozin kinaz ailesinden ROR1'in HCC'de ifadesi ve fonksiyonuna dair çalışma bulunmamaktadır. Bundan dolayı, bu tez çalışmasında HCC'de ROR1 ifadesi ve hepatokarsinogenez süreci ile ilişkisi araştırılmıştır. Rekombinant ROR1 proteini bakteriyal olarak sentezlenmiş ve ROR1 monoklonal antikorlarının oluşturulması amacıyla immünojen olarak kullanılmıştır. HCC'de ROR1 ifadesi, RT-qPCR ile gen ifadesi seviyesinde ve geliştirdiğimiz monoklonal antikorlar kullanılarak western blot ile protein seviyesinde gösterilmiştir. ROR1'in hepatokarsinogenezdeki fonksiyonel katkısı, HCC hücrelerinde shRNA ile ROR1 ifadesinin baskılandığı hücre klonlarında, apoptoz, hücre siklusu, hücre göçü ve ilaç-atılımı analizleri ile belirlenmiştir. Bununla birlikte, HCC hücre hatlarından izole edilen eksozomlarda ROR1 ifadesi incelenmiş ve ROR1 bağımlı eksozomal miRNA kargo içeriğindeki değişiklikler saptanmıştır. Yeni geliştirilen ROR1 monoklonal antikorları insan ve fare HCC hücre hatlarında endojen ROR1 proteinini özgül olarak tanımaktadır. ROR1'in baskılanması sonucunda hücre proliferasyonu ve hücre göçü azalmakta, buna karşın apoptoz ve anoikise direnç artmaktadır. ROR1 baskılanmış hücrelerdeki kemoterapiye direncin artmış ilaç transportu ve çoklu-ilaç direnç genlerinin ifadelerindeki artıştan kaynaklandığı saptandı. HCC hücre hatlarından izole edilen eksozomlarda ROR1 ifadesi gösterildi ve ROR1 ifadesinin baskılandığı hücrelerden izole edilen eksozomlarda hücre göçünü baskılayan miRNA'ların arttığı belirlendi. ROR1, HCC'de ifade edilmekte ve hastalığın gelişimine çoklu sinyal yolaklarını etkileyerek katkı sağlamaktadır. HCC'de ROR1 ifadesinin incelenmesi tanı ve tedavi açısından önemli katkılar sağlayabilecektir. Bu tez çalışması TÜBİTAK SBAG215S751 projesi ve 2214A Doktora Sırası Yurt Dışı Araştırma bursu ile desteklenmiştir.Hepatocellular carcinoma (HCC) is among the most frequent and deadly cancers, yet tools for its early diagnosis and treatment are limited. The expression and role of receptor tyrosine kinase ROR1 in HCC have not been elucidated so far. Thus, the expression of ROR1 in HCC and its significance in hepatocarcinogenesis were investigated in this thesis work. Recombinant ROR1 protein was produced in bacteria and used as an immunogen for the generation of ROR1 monoclonal antibodies. The levels of ROR1 transcripts and proteins in HCC were detected by RT-qPCR and homemade monoclonal antibodies-based western blotting, respectively. The functions of ROR1 in hepatocarcinogenesis were explored through analyses of apoptosis, cell cycle, cellular migration and drug efflux in HCC cell lines, and cell clones in which the expression of ROR1 is repressed by shRNA. In addition, the expression of ROR1 was sought out in exosomes that were isolated from HCC cells lines and ROR1 dependent changes of miRNA cargo content of exosomes were analysed. The novel ROR1 monoclonal antibodies specifically recognized endogenous ROR1 protein both in human and mouse HCC cell lines. The suppression of ROR1 expression caused a decrease in cellular proliferation and cell migration, while the cells displayed increased resistance to apoptosis and anoikis. We also found that the chemoresistance of cells with repressed ROR1 expression is due to the increased drug efflux and upregulation of multidrug resistance genes. The expression of ROR1 was detected in HCC-derived exosomes and the expression of miRNAs that inhibit cell migration increased in the exosomes that isolated from ROR1-depleted HCC cells. ROR1 is expressed in HCC and contribute to the development of this cancer by affecting multiple signaling pathways. A detailed investigation of ROR1 in HCC will offer an insight into the diagnosis and therapy of HCC. This thesis supported by TUBITAK SBAG215S751 and 2214A Schoolarship.