ATP-bağımlı proteaz lon geninin Geobacillus kaustophilus'tan klonlanması, DNA dizisinin belirlenmesi ve ekspresyon

Abstract

La olarak da adlandırılan lon proteaz, ilk olarak Escherichia coli den saflaştırılmış ilk ATP-bağımlı proteazdır. Lon proteaz, diğer ATP-bağımlı proteazlarda (FtsH, ClpAP, ClpXP, HslVU ve 26S proteazom) olduğu gibi AAA+ protein süper ailesine (ATPase associated with diverse cellular activities) aittir. Lon proteazlar hücre içi proteolizisden sorumlu anahtar enzimlerdir. Mutant ve anormal proteinleri elimine ederek hücre içinde protein kalite kontrolüne ve kısa-süreli düzenleyici proteinlerin yıkımına katılarak hücresel normal şartların devamlılığının sağlanmasına katkıda bulunurlar. Lon proteaz homologları sadece bakterilerde değil, insan, maya ve bitkilerde de bulunmuştur. Bu bilgiler Lon'un çok önemli bir biyolojik rol oynadığını göstermektedir. Bununla beraber Lon proteazın proteolitik aktivitesi ve ATP-bağımlı durumda çeşitli substratları nasıl tanıyabildiği hala tam olarak açık değildir.Bu tez çalışmasında, thermofilik bir bakteri olan Geobacillus kaustophilus'un Lon proteazı ilk defa Escherichia coli `de klonlanmış ve eksprese edilmiştir. Yaklaşık 2500 bç uzunluğundaki lon geni önce bir klonlama vektörü olan pGEM-T vektöre ve daha sonra E. coli'de pGEX 6P-1 vektörüne alt-klonlama yapıldıktan sonra aktarılmıştır. Yaklaşık 87 kDa büyüklüğündeki Lon proteaz glutathione S-transferaz (GST 26 kDa) füzyon proteini ile DH5? E.coli'de eksprese edilmiştir.Lon protease (also called La) is the first isolated ATP-dependent protease in E. coli. Lon is a member of the AAA+ super family (ATPase associated with diverse cellular activities) like all other ATP-dependent proteases (FtsH, ClpAP, ClpXP, HslVU ve 26S proteazom). Lon proteases are key enzymes responsible for intracellular proteolysis, contributing to protein control and cellular homeostasis by eliminating mutant and abnormal proteins and participation in rapid turnover of short-lives regulatory proteins. Homologs of the lon protease are found not only in bacteria also in human, yeast and plants. These observations indicate that Lon may play crucial biological roles in various organisms. However how Lon protease recognises a variety of substrates in ATP dependent manner is still unclear.In this study, Geobacillus kaustophilus ATP dependent Lon protease first time cloned and expressed in E. coli. About 2500 bp lon gene first cloned into pGEM-T cloning vector then subcloned into pGEX 6P-1 in E. coli. Lon, 87 kDa molecular weight, were expressed with glutathione S-transferaz (GST 26 kDa) as a fusion protein.